مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تعزيز محاذاة المحاور العصبية وتكوين النخاع للخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية باستخدام نظام ثقافة الخلايا الثابت الممتد مسبقا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال هندسة الأنسجة العصبية ، مثل محاذاة المحاور ونمو السماكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذه الطريقة الممتدة مسبقا لا تعزز محاذاة المحاور العصبي فحسب ، بل تعزز أيضا تكوين النخاع.

لبدء هذا الإجراء ، اسكب خليط القاعدة وعامل المعالجة في طبق زراعة الأنسجة. احتفظي بخليط الجل تحت الفراغ لمدة 20 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء. ثم ضعي خليط الجل في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية للعلاج طوال الليل.

بعد أن يعالج غشاء PDMS ، عالج السطح ببلازما الأكسجين في نظام تنظيف البلازما ونقشها لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قطع قطعة من الغشاء المستطيل من الطبق. قم بتثبيته على إطار مطاطي بحيث يكون الجانب المعالج بالأكسجين متجها لأعلى.

ثم ضع الإطار على مرحلة التمدد وقم بتمديده بالتساوي عن طريق تدوير المقبض على المسرح حتى يصل إلى 10٪ استطالة في المحور الأطول. بعد ذلك ، قم بإصلاح التمدد عن طريق شد البراغي الموجودة على الإطار. بعد ذلك ، قم بإزالة الإطار من المسرح.

تأكد من أن سطح الغشاء جاف وخالي من الغبار قبل وضع حجرة سيليكون على الغشاء. اسمح للجانب اللزج من الغرفة بالالتصاق بإحكام بالغشاء. ثم تعقيم السطح بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PLL إلى سطح PDMS في الغرفة في غضون ست ساعات من العلاج بالبلازما. بعد ذلك ، احتضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية قبل بذر الخلايا العصبية DRG لتعزيز ارتباط الخلية. في هذه الخطوة ، قم بإعداد وسيط النمو القياسي للخلايا العصبية DRG.

قبل العزل ، قم بالتعقيم لمعدات العزل وكواشف التصفية. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل في بئر واحد من صفيحة مكونة من ستة آبار وضع الطبق على الجليد. ثم قم بإعداد 10 مل من وسط التفكك عن طريق إضافة ملليلتر واحد من الكولاجيناز A إلى تسعة ملليلتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA.

قم بتصفية المحلول بفلتر 0.22 ميكرومتر وضعه على الثلج. بعد ذلك ، ضحي ب 10 إلى 12 فئران SD تتراوح أعمارها بين خمسة إلى سبعة أيام وقم بقطع الجلد الذي يغطي الحبل الشوكي من الجزء الخلفي من كل واحدة. قم بإزالة أي أنسجة زائدة حول العمود الفقري.

تحت المكبر الجراحي ، قم بعمل أول شق من الرقبة ثم قم بعمل قطع واحد على طول العمود الفقري على كلا الجانبين بالمقص. افصل العمود الفقري عن جسم الجرو وقم بإزالة العضلات الزائدة. ثم اقطع على طول المحور الطويل للعمود الفقري واستخدم الملقط لفتح العمود الفقري بالكامل لاستخراج الحبل الشوكي.

بعد ذلك ، قم بإزالة العقدة من جيب العظام. تقليم جذور الأعصاب ونقل العقد إلى عازلة العزل المثلج. اجمع ما يقرب من 10 إلى 16 DRGs من كلا الجانبين.

كرر إجراء التشريح لبقية الجراء. الآن ، قم بنقل DRGs مع عازلة العزل إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا. دع الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب وقم بإزالة المخزن المؤقت للعزل في الأعلى برفق.

ثم أضف 10 مل من وسط التفكك في الأنبوب. احتضان الأنسجة المقطعة في وسط التفكك في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع هز الأنبوب كل خمس إلى 10 دقائق. بعد التفكك الكيميائي ، قم بالطرد المركزي للعقد عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط النمو القياسي وقم بدوامها. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا المنفصلة مرة أخرى. ثم قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسط النمو القياسي وقم بدوامها.

قبل بذر الخلايا ، قم بإزالة محلول PLL من الغرفة. اشطف سطح PDMS بالماء المعقم وجففه بالهواء. بعد إعادة تعليق الخلايا ، اترك التعليق لمدة دقيقة إلى دقيقتين للسماح للحطام بالاستقرار في قاع الأنبوب.

بعد ذلك ، أضف 1.5 مل من تعليق الخلية في كل غرفة ممتدة واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للقضاء على الخلايا الدبقية في يوم واحد في المختبر ، أضف 10 ميكرولتر أو 15 ميكرولترا من محلول مخزون خليط FDU-U إلى كل بئر. بعد سبع ساعات ، استبدل هذا الوسيط بوسط نمو قياسي جديد وضع جهاز الاستزراع الممتد مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

خلال فترة زراعة الخلايا ، قم بتغيير الوسط كل يومين عن طريق استبدال نصف الوسط المستهلك بوسط جديد. في هذا الإجراء ، قم بإزالة وسط الثقافة من خلايا Schwann وأضف خمسة ملليلتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA إلى القارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر البصري باستخدام هدف 10X لمعرفة ما إذا كانت ترتفع من القارورة. ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة إلى الخلايا الموجودة في القارورة واخلطها. بعد ذلك ، أضف تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في سبعة ملليلتر من وسط نمو DRG القياسي. بعد ذلك ، قم بنقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. امزجها مع 10 ميكرولترات من Trypan blue ثم احسب رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم باستخدام هدف 10X.

أضف وسط نمو DRG لتخفيف تعليق الخلية إلى 5 ، 000 خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بإزالة 0.5 مل من الوسط من ثقافة DRG في الغرفة الممتدة وأضف 0.5 مل من تعليق خلية Schwann إلى ثقافة DRG. استزراع الخلايا لمدة أسبوع عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.

قم بتغيير الوسط كل يومين عن طريق استبدال نصف الوسط المستهلك بوسط نمو قياسي جديد. بعد الزراعة على الأسطح الممتدة وغير الممتدة لمدة أسبوعين ، تمت إضافة خلايا شوان المنقاة إلى الغرفة واستزراعها لمدة أسبوع آخر. يظهر هنا تلطيخ بيتا III للمحاور العصبية على السطح الممتد.

وهذا هو تراكب توبولين بيتا III و P0 تلطيخ على السطح الممتد ، مما يشير إلى أن خلايا شوان مرتبطة بالمحاور العصبية ومن المحتمل أن تكون نخاعية. تظهر هذه الصورة تلطيخ التوبولين beta-III للمحاور العصبية على السطح غير الممتد. ويشير تراكب توبولين بيتا III و P0 تلطيخ على السطح غير الممتد إلى أن خلايا شوان غير متصلة بالمحاور.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على غشاء PDMS مسطحا وسمكا متجانسا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء البخاخات مثل القنوات الدقيقة الممتدة مسبقا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العدسة المحورية وهجرة خلايا شوان.

بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف دور تباين السطح في تجديد الأعصاب في الحبل الشوكي والعصب الوركي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز محاذاة المحاور وتكوين النخاع باستخدام جهاز ممتد مسبقا.