شريط الفحص لدراسة آخر جذاب أو مثيرة للاشمئزاز من الركيزة البروتين عن طريق فصل الخلايا العصبية الحصين

يتمثل الهدف العام من اختبار الخطوط (stripe assay) في تقييم قدرة بروتينات معينة، مثل جزيئات التوجيه، على جذب أو تنفير الخلايا العصبية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال توجيه المحاور العصبية، مثل كيفية هجرة الخلايا العصبية أو مد محاورها استجابةً للبيئة الخلوية الخارجية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تصور عدد كبير من الخلايا العصبية في تجربة واحدة، وتحليل العديد من مخاريط النمو في وقت واحد.

كجزء من التحضير، قم بغلي أربع إلى ثماني قوالب سيليكون في الماء لمدة خمس دقائق. اتركها لتجف تماماً في الهواء تحت غطاء تدفق رقائقي مع توجيه الجوانب المخططة للأعلى. تستغرق هذه العملية حوالي ساعة واحدة.

استمر في العمل تحت غطاء التدفق الصفائحي. استخدم الهواء المضغوط أو الشريط اللاصق لإزالة أي غبار عن الجانب المخطط من المصفوفات. ثم ضع كل مصفوفة بعناية في طبق بلاستيكي منفصل بقطر ستة سنتيمتر، بحيث يكون الجانب المخطط للأسفل.

اضغط بإصبع واحد على كل مصفوفة بإحكام. تجنب حبس فقاعات الهواء بين المصفوفة والطبق. إذا لم تلتصق المصفوفة، كرر العملية.

بمجرد الالتصاق، حدد موقع الخطوط على الجانب السفلي من طبق الزرع. قم بتحضير البروتينات المؤتلفة الموصومة فلورياً في PBS. جهز 25 µL لكل طبق مخطط.

اترك الخليط ليتخمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، وبالنسبة لكل طبق، املأ سرنجة قياس 22 بـ 25 microliters من البروتين المخفف واحقه من خلال الثقب الصغير الموجود على جانب المصفوفة. تجنب حقن فقاعات الهواء داخل المصفوفات لأنها ستؤدي إلى تشويش ارتباط البروتينات بالأطباق الخاصة بها.

الآن، قم بحضن الأطباق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد فترة التحضين، ضع 300 microliters من PBS في الفتحة العلوية لكل مصفوفة. ثم اسحب PBS من ثقب صغير موجود على جانب كل مصفوفة لإزالة جميع البروتينات المؤتلفة غير الملتصقة.

لا تقم بشفط محلول PBS بالكامل لأن البروتينات ستجف. قم بإجراء عملية الشطف هذه بمحلول PBS ثلاث مرات في المجمل. بعد ذلك، قم بإزالة المصفوفة بعناية من كل طبق.

ثم أضف فوراً حوالي 100 µL من البروتين الضابط فوق كامل المنطقة المخططة، لتكوين طبقة تغطية متبادلة في كل طبق. بعد ذلك، قم بحضن الأطباق لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. وفي هذه الأثناء، قم بإذابة laminin وPBS على الثلج بتركيز 20 µg/mL.

بعد مرور 30 دقيقة، اغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتغطية كل طبق بحوالي 100 microliters من اللامينين البارد وأعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة ساعة أخرى. وبعد ساعة، استخدم PBS لغسل الأطباق ثلاث مرات أخرى.

بعد الغسلة الثالثة، أضف حوالي 150 µL من وسط الزرع إلى كل طبق. ثم قم بحضن الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5% عند درجة حرارة 37 °C حتى يحين موعد استخدامها التالي. بعد القتل الرحيم لفأر مانح في المرحلة E15.5، قم بقص الجلد والجمجمة سهمياً عند الخط الناصف للرأس باستخدام مقص جراحي واستخرج الدماغ باستخدام ملعقة دقيقة (micro spatula).

انقل الدماغ بعناية إلى طبق بتري سعة 60 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliters من HBSS. في الطبق، استخدم مشرطاً لاستئصال النصفين الكرويين بما في ذلك القشرة المخية والحصين والمخطط. ثم قم بتشريح مناطق الحصين عن طريق إزالة السحايا بعناية.

انقل أنسجة الحصين المُشرحة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter يحتوي على 2 milliliters من محلول HBSS على الثلج. تكفي ستة حصينات من ثلاثة أجنة لزراعة العصبونات في ثماني أطباق. بعد جمع كافة أنسجة الحصين، اشفط محلول HBSS واستبدله بـ 2 milliliters من trypsin-EDTA.

بعد ذلك، يتم تحضين الأنبوب لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. تالياً، يتم تحييد نشاط التريبسين بإضافة 500 µL من مصل الجنين البقري. ثم تُفصل المادة في جهاز الطرد المركزي بسرعة 100 Gs لمدة خمس دقائق.

أزل السائل الطافي واغسل الراسب بـ 2 mL من وسط الزرع. بعد ذلك، قم بطرد الخليط مركزياً مرة أخرى واستبدل الوسط بكمية إضافية من الوسط. الآن، قم بتفكيك النسيج عن طريق السحق اللطيف باستخدام رأس ماصة سعة 1 mL مقطوع الطرف.

قم بتمرير الأنسجة صعوداً وهبوطاً عبر رأس الماصة حوالي 10 مرات. بعد ذلك، استخدم رأس ماصة سعة 1 mL غير مقطوع وكرر عملية التفتيت (trituration) للحصول على معلق من الخلايا المفردة. الآن، قم بعزل الخلايا المفردة عن طريق تمرير المعلق عبر مصفاة خلايا ذات مسام تتراوح بين 80 إلى 100 micron.

بعد ذلك، يتم طرد السائل العالق المُرشّح مركزياً عند 150 Gs لمدة خمس دقائق، ثم يتم سحب السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب في 2 milliliters من وسط الزرع. تُعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ويتم زرع 10,000 من العصبونات في 150 microliters من وسط الزرع على كل طبق مخطط مُعد مسبقاً. يتم ترسيب السائل العالق بعناية لتغطية المنطقة المخططة بالكامل.

تم زرع عصبونات حصينية مفككة من فئران في المرحلة الجنينية E15.5 واستزراعها لمدة 24 ساعة على خطوط من البروتين الضابط FC المسمى فلورياً، أو تم زرع العصبونات على خطوط من FLRT2 FC بالتناوب مع البروتين الضابط FC غير المسمى. في كلتا الحالتين، تجمعت العصبونات ومدت محاورها العصبية في شكل حزم. أما على البروتين الضابط FC، فقد توزعت العصبونات بشكل متساوٍ ومدت محاورها العصبية في اتجاهات عشوائية. وفي المقابل، عند استزراعها مع خطوط FLRT2 FC، تجنبت المحاور العصبية النمو في مناطق FLRT2 FC.

وبذلك، نمت المحاور العصبية الممتدة بشكل أساسي على خطوط FC. ويظهر التكبير الأعلى أن المحاور نمت على طول الحدود مع خطوط FLRT2 FC، ولكنها لم تمتد إلى منطقة FLRT2. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء سجادة مخططة من البروتينات الموصى بها وتقييم نشاط الجذب أو التنافر باستخدام عصبونات الحصين المفككة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون خمس ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.