استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق

الهدف العام من استراتيجية العزل الجديدة هذه هو توسيع نطاق عدد عزلات الفيروسات الجديدة من أجل دراسة الجينوم الشامل (pan-genome) لهذه العائلة الفيروسية الجديدة، وفهم أنظمتها البيئية وإمكانية إمراضيتها للبشر بشكل أفضل. يمكن لهذه الطريقة أن تجيب على أسئلة جوهرية في مجال علم الفيروسات، مما يساعد علماء الفيروسات حول العالم المهتمين بالتنقيب عن الفيروسات العملاقة وفيروسات Faustoviruses على وجه الخصوص. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تقدم تحسينات جديدة في مراحل عديدة، مثل خليط المضادات الحيوية ومضادات الفطريات، ووسط التجويع الجديد المكيّف للأميبا، واستخدام قياس التدفق الخلوي (flow-cytometry) للكشف عن التحلل بشكل أسرع وأكثر حساسية. بعد جمع عينات المياه الملوثة وفقاً للبروتوكول المذكور، يتم تحضير الخلية المضيفة، V. vermiformis، عن طريق إضافة الأميبا إلى دورق زراعة خلايا بمساحة 75 square centimeter مع 30 milliliters من مستخلص جلوكوز الخميرة وببتون البروتياز، أو وسط PYG، والحضن عند 28 °C لمدة 48 hours. تُستخدم شرائح العد لحساب الأميبا، وعندما تصل تركيزاتها إلى 5 × 10⁵ إلى 10⁶ cells per milliliter، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 720 ×g لمدة 10 minutes.

قم بشفط السائل الطافي، واستخدم 30 milliliters من محلول باج الملح للأميبا المعقم (Page's amoebal saline) أو PAS لإعادة تعليق كتلة الأميبا. بعد شطف الكتلة للمرة الثانية، استخدم 30 milliliters من وسط التجويع (starvation medium)، الذي يحتوي على مضاد حيوي ومضاد للفطريات، لإعادة تعليق الخلايا بتركيز يصل إلى 10⁶ أميبا لكل milliliter تقريبًا. يسمح وسط التجويع للأميبا بالبقاء على قيد الحياة دون تكوين تكيسات أو تكاثر.

بعد ذلك، قم باستزراع 200 µL من الأميبا في آبار طبق ذو قاع مسطح مكون من 96 بئراً، وحضنها عند 30 °C لمدة 30 دقيقة. ثم، بعد رج عينات المياه باستخدام جهاز الـ vortex لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، قم بتلقيح 25 µL من كل عينة على خلايا الأميبا، مع ترك بئرين بدون عينة كضوابط سلبية. ولتجنب التبخر، ضع الطبق الذي يحتوي على المزرعة الأولية في كيس مع كمادة مبللة، ثم ضع الحجرة المرطبة وبداخلها الطبق في حاضنة عند 30 °C.

بعد ثلاثة أيام من التلقيح الأول، قم بنقل المزرعة الأولية إلى طبق جديد بـ 96 بئراً يحتوي على الأميبات كما تم توضيحه للتو، دون إجراء أي فحص مجهري. يتم التحضين عند 30 درجة Celsius لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، وباستخدام المزرعة الثانوية، قم بتلقيح طبق ثالث كما هو موضح سابقاً، ثم يتم التحضين لمدة يومين.

للكشف عن التحلل في لوحة الزراعة المشتركة النهائية، قم بتشغيل جهاز قياس التدفق الخلوي (cytometer) وإجراء عملية التنظيف والشطف وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لتقليل الضوضاء في الخلفية. ولإجراء عملية اكتساب مؤتمتة بالكامل لمدة 40 دقيقة، قم بتشغيل أداة أخذ العينات عالية الإنتاجية (high throughput sampler) أو HTS لتحميل العينات تلقائياً من لوحة الـ 96 بئراً وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. قم ببرمجة إعدادات HTS كما هو مدرج هنا، والتي تشمل حجم عينة 150 µL، وحجم خلط 50 µL، وسرعة خلط 180، وعدد مرات الخلط 5، وحجم غسيل بين العينات 400 µL، ومعدل تدفق 2.5 µL/s، وعدد الأحداث المسجلة 10,000. انقر على home للسماح لـ HTS بتحديد موقع اللوحة. ثم قم بتقييم آبار الضبط السلبي التي تحتوي على خلايا الأميبا المضيفة أولاً، وذلك لتعيين بوابات (gate) مجتمع الأميبا، وتحديد النسبة المئوية للخلايا وفقاً لخصائصها الفيزيائية. تأكد من الحصول على مجتمع أميبا متجانس ومجتمع ثانٍ من الأحداث الأقل التي تقابل الحطام والضوضاء. بعد ذلك، ابدأ عملية تحديد البوابات بالنقر على acquire sample.

بعد ذلك، استخدم السهم الذي يحدد البوابات لتحديد مجتمع الأميبا المستهدف. بعد تحديد بوابة تضم 10,000 حدث على الأقل، انقر على run للسماح لنظام HTS بتشغيل اللوحة بأكملها تلقائيًا. قم بإجراء الحصول على البيانات وتحليلها وفقًا لمعامل الحجم (forward scatter) ومعامل البنية (side scatter). ارجع إلى النص للحصول على تفاصيل إضافية.

بعد الكشف عن التحلل بواسطة قياس التدفق الخلوي، قم بسحب المزارع المشتركة المتحللة باستخدام الماصة لتعليق الأميبات المتبقية. بعد وضع 50 µL من كل عينة على الشرائح، قم بإجراء الطرد المركزي الخلوي للمعلق مباشرة عند 800 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، استخدم الميثانول النقي لتثبيت الشرائح، ثم اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، اغمر الشرائح في محلول ESN ثلاث مرات لمدة أربع ثوانٍ في كل مرة قبل وضع الشرائح في صبغة blue-azur لمدة ست ثوانٍ. وأخيرًا، اغمر الشرائح في محلول PBS لمدة 45 ثانية.

اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة قبل الانتقال إلى الفحص. ولصبغ الشرائح المثبتة حديثاً بصبغة DAPI، قم بنقل 15 µL من DAPI إلى الشرائح الجافة بواسطة الماصة. افحص الشرائح تحت المجهر الضوئي بقوة تكبير 1000x للتحقق من وجود مصانع الفيروسات.

لإجراء المجهر الإلكتروني، يتم ترسيب 5 µL من العينة الموجبة على شبكة مُعالجة بالتفريغ المتوهج (glow-discharged grid)، وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تقريبًا. تُجفف الشبكة بعناية، ثم تُضاف كمية صغيرة من موليبدات الأمونيوم بتركيز 1% وتُحضن لمدة 10 ثوانٍ. بعد إزالة القطرة بعناية، تُترك الشبكة لتجف لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يُضبط المجهر الإلكتروني على 200 keV. ثم تُوضع الشبكة في الحامل ويُدخل الحامل في المجهر. يتم النقر على أيقونة نظرة عامة على الفراغ (vacuum overview) والتحقق من الفراغ. ثم تُغلق الصمامات، ويُضبط حجم البقعة (spot size) على 5، وقوة التكبير على 25,000 قبل بدء الملاحظة. بعد تحديد موقع فيروس عملاق على شاشة الالتقاط، تُستخدم أداة القياس لقياس الفيروس.

قم بإجراء البيولوجيا الجزيئية وتسلسل الجينوم الفيروسي وفقاً للبروتوكول المكتوب.

يوضح هذا الشكل نتائج الكشف عن اثنين من فيروسات Faustoviruses مقارنةً بعينات ضابطة سلبية موثوقة. احتوت العينة الضابطة السلبية لعملية التحلل على مجموعة من الأميبا بنسبة 86%. وفي المقابل، تحللت أكثر من 60% من الأميبا، مع تسجيل أعلى نسبة من الحطام في العينات الإيجابية.

كما يتضح هنا، تصبغ صبغات ESN وblue-azur نوى خلايا الأميبا غير المصابة والمصابة، وتظهر وجود مصانع الفيروسات داخل الخلايا المصابة. كما يؤكد صبغ DAPI وجود مصانع الفيروسات داخل الأميبا. وفي هذه الصور، يكشف المجهر الإلكتروني عن وجود Faustovirus بالمظهر النموذجي للفيروسات العملاقة (mega-virus) المكونة من كبسيدة عشرينية الوجوه تفتقر إلى الليفات ويبلغ حجمها 200 nanometers.

بمجرد إتقان هذه التقنية وبعد عملية الزراعة المشتركة، يمكن إتمام عملية الكشف عن التحلل وتوصيف الفيروس في غضون ساعة واحدة، إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التحكم في حيوية الأميبا والتحقق من أي تلوث محتمل. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البيولوجيا الجزيئية التي تستهدف الفيروسات العملاقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل عائلة الفيروس أو النمط الجيني.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لاستكشاف هذه الفصيلة الفيروسية، ومضيفها المحدد، وإمراضيتها المحتملة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الفيروسات العملاقة بسهولة من خلال توسيع عدد وأنواع العينات واختيار أفضل خلية مضيفة وأفضل ظروف الزرع. لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات التي قد تكون ممرضة للبشر يمكن أن يكون خطيراً للغاية، خاصة عند التعامل مع عينات مياه الصرف الصحي.

لذلك، يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل في مختبرات SB2 ذات الظروف الآمنة، عند تنفيذ هذا الإجراء.