تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصميم نظام توصيل يمكنه توصيل أدوية الجزيئات الصغيرة مثل siRNA إلى الدماغ. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنكس العصبي مثل هل siRNA خيار علاجي قابل للتطبيق لأمراض البروتين الخاطئ؟ وهل يمكننا تصميم نظام موثوق به لتوصيل الأدوية إلى الدماغ؟

الميزة الرئيسية لإنشاء نظام توصيل الأدوية الشحمية هي أنه يمكننا توصيل الحمض النووي الريبي الخاص بنا عن طريق الوريد أو من خلال مجرى الدم بدلا من الأنسجة العصبية مباشرة مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاجات وتشخيص الأمراض التنكسية العصبية لأن هذه التقنية تسمح بتوصيل محدد عبر الحاجز الدموي الدماغي ، وتحديدا للخلايا العصبية التي تعبر عن الأسيتيل كولين. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم حقن وريد ذيل الفأر بسبب صغر حجم وريد ذيل الفأر.

ابدأ بإعداد نسبة DOTAP إلى الكوليسترول من واحد إلى واحد. لتحضير الجسيم الشحمي الحيواني الأجنبي ، امزج نانومولين من DOTAP واثنين من النانومول من الكوليسترول في عشرة ملليلتر من محلول الكلوروفورم الفردي إلى الميثانول. ثم تبخر تسعة ملليلتر من محلول الكلوروفورم والميثانول باستخدام غاز النيتروجين.

تبخر آخر مليلتر من المذيب في غطاء الدخان طوال الليل بدون غاز. في اليوم التالي ، يجب أن يكون هناك فيلم دهني رقيق مرئي في الجزء السفلي من القارورة. قم بتسخين كل من هذه القارورة بغشاء الدهون وعشرة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة عشرة بالمائة إلى 55 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتقطيع محلول السكروز الساخن ببطء على طبقة الدهون الرقيقة أثناء تحريك القارورة برفق. بعد ذلك ، قم بتجميع الطارد بمرشحات ميكرون واحد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف ملليلترا واحدا من تعليق الجسيم الشحمي الساخن إلى أحد المحاقن الموجودة على الطارد.

ثم مرر التعليق بين المحاقن 11 مرة. مع الحفاظ على تسخين تعليق الجسيمات الشحمية لتسهيل التحجيم ، قم بقياس الجسيمات الشحمية من خلال 45 ميكرون ومرشح 2 ميكرون لتوليد حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة ، أضف بعد ذلك 20 ميكرولترا من تعليق الجسيمات الشحمية النانوية الأربعة إلى 200 ميكرولتر من محلول siRNA 20 ميكرومولار واحتضانه لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 80 ميكرولترا من مخزون 500 ميكرومولار من RVG-9R الذي يستهدف الببتيد إلى محلول الجسيم الشحمي siRNA واحتضانه لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بإعداد تعليق ليبسوموي حيواني أجنبي عن طريق خلط 2.2 نانومول من DSPE أو DOTAP في عشرة ملليلتر من محلول كلوروفورم ثنائي إلى واحد إلى محلول ميثانول مع 1.6 نانومول من الكوليسترول و 2 نانومول من مد DSPE. بعد ذلك ، ضع غاز النيتروجين وعندما يتبخر معظم المذيب ، اترك القارورة في غطاء الدخان طوال الليل. ثم أضف ببطء عشرة ملليلتر من 1X PBS المسخن إلى 75 درجة مئوية إلى الطبقة الدهنية الرقيقة.

اسمح للدهون بإعادة الترطيب عند 75 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التحجيم. بعد تغيير حجم معلق الجسيمات الشحمية باستخدام الطارد كما كان من قبل ، قم بتقطيع 20 ميكرولترا من كل من المعلقات الشحمية النانوية الأربعة في كميات تستخدم مرة واحدة وقم بالتجميد لمدة 30 دقيقة باستخدام مجفف تجميد أعلى مقاعد البدلاء. بعد ذلك ، أضف 1.4 ميكرولتر من محلول 26.6 ميكرومولار من كبريتات البروتامين إلى 200 ميكرولتر من محلول siRNA 20 ميكرومولار واحتضانه لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكثيف siRNA.

بعد الحضانة ، قم بترطيب أطباق DSPE ب 201.4 ميكرولتر من محلول البروتامين siRNA. أعد ترطيب أطباق DOTAP ب 200 ميكرولتر من محلول مخزون حيواني أجنبي من siRNA. احتضان كل محلول siRNA الشحمي لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف عشرة ميكرولترات من محلول EDC 60 مللي مولار إلى كل أنبوب من الجسيمات الشحمية المرطبة. ثم أضف عشرة ميكرولترات من محلول 150 ملي مولار sulfo-NHS إلى محلول siRNA الشحمي لكل من أحمر DOTAP و DSPE. احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

أخيرا ، أضف 80 ميكرولترا من مخزون 500 ميكرومولار من ببتيد RVG-9R إلى محلول الربط المتقاطع للجسيم الشحمي siRNA واحتضانه لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تخدير الفأر باستخدام اثنين إلى ثلاثة بالمائة من الأيزوفلوران في الأكسجين ، قم بتغطية عيون الفأر بمرهم الذمة وتأكد من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. تابع فقط في حالة غياب التفاعل.

أثناء الحفاظ على التخدير ، ضع الفأر على ظهره أو جانبه للوصول إلى وريد الذيل. امسح الذيل بنسبة 70 في المائة من الإيثانول ثم استخدم حقنة أنسولين قياس 26 لحقن 300 ميكرولتر من LSPCs أو الأذونات في وريد الذيل. ابدأ بالحقن بعيدا وتحرك بالقرب من الوريد إذا انهار الوريد أو تمزق.

ضع الماوس في قفص نظيف حتى يحافظ على الرق القصي. راقب لعدة ساعات بعد الحقن للتأكد من زوال التخدير وعدم وجود آثار سيئة للعلاج. بعد السماح ل LSPCs أو الأذونات بالدوران لمدة 24 ساعة على الأقل ثم القتل الرحيم للفأر ، قم بتشريح نصف نصف الكرة الأرضية من الدماغ.

ثم ضع نصف الكرة الأرضية و 2.5 مل من المخزن المؤقت للفاكس على مصفاة خلية شبكية 40 ميكرون واستخدم مكبس المحقنة للضغط على الأنسجة من خلال المرشح في طبق بتري. اشطف مصفاة الخلية وطبق بتري بسعة 2.5 مل إضافية من مخزن الفاكس. ثم انقل معلق الخلية المفردة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وضعه على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتحويل 100 ميكرولتر من معلق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 350 مرة G. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من عازلة الفاكس وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. ثم أضف مليلتر آخر من المخزن المؤقت للفاكس وضع تعليق الخلية على الجليد. الآن ، احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من كتلة Fc المضادة للفئران في مخزن الفاكس المؤقت لمدة 30 إلى 60 دقيقة على الجليد.

بعد التكوير والغسيل كما كان من قبل ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضاد للأجسام الفلورية الأساسي وضعه على الثلج لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول تحلل RVC لمدة دقيقة واحدة. ثم ، بيليه الخلايا.

بعد التخلص من المخزن المؤقت ، قم بتعليقه في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس وضعه على الثلج. الخلايا جاهزة الآن لتحليل الفاكس. أظهرت الفئران المعالجة بالحمض النووي الريبي الذي تم تسليمه عبر LSPCs انخفاضا كبيرا في مستويات بروتين البريون الخلوي مقارنة بعنصر تحكم PBS الذي يظهر مستويات بروتين البريون الخلوي أثناء النوع.

أظهرت الفئران المعالجة LSPCs مستويات بروتين البريون الخلوي قريبة من تلك الموجودة في بروتين البريون الذي يضرب الفأر. عبر ثلاث تجارب ، أظهرت الفئران المعالجة ب LSPCs انخفاضا كبيرا في مستويات بروتين البريون الخلوي مقارنة ب PBS أثناء عناصر التحكم في النوع. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يمكن تخزين الجسيمات الشحمية في الثلاجة لعدة أشهر ، ولكن يجب استخدام LSPCs الكاملة في غضون 24 ساعة بعد التجميع.

بعد تطويره ، سيمهد توليد LSPCs أو النكهات الطريق للباحثين لاستكشاف المزيد من الخيارات العلاجية في مجال الأمراض التنكسية العصبية.