التساهمية ملزم من الأجسام المضادة لالسليلوز أقراص الورق وتطبيقاتها في العين المجردة اللونية يمونواسايس

الهدف العام لهذه المنهجية هو تثبيت الأجسام المضادة والبروتينات على مصفوفة السليلوز لتسهيل تطوير مقايسة مناعية لونية بالعين المجردة والتي يمكن أن تكون مفيدة لتشخيص نقاط الرعاية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تشخيص نقاط الرعاية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على استقرار البروتين على السليلوز مما يسمح بتطوير فحوصات تشخيصية ورقية منخفضة التكلفة.

ستظهر الإجراء غلوريا تشانغ ، طالبة من مختبري. للبدء ، قم بإعداد قطعة واحدة من الورق المربع بأبعاد سنتيمتر واحد × سنتيمتر واحد. قم أيضا بإعداد 100 قرص ورقي مصنوع من ورق السليلوز رقم واحد من الدرجة الأولى بقطر 6.0 ملم باستخدام ثقب ثقب.

لاشتقاق مجموعات أمينية على الأقراص الورقية ، امزج ملليلتر واحد من APS و 10 مل من الأسيتون في زجاجة زجاجية سعة 50 مليلتر في غطاء الدخان. أضف الأقراص الورقية إلى خليط الكاشف APS المحضر حديثا. ثم احتضان الأقراص في الخليط لمدة خمس ساعات مع التحريك المداري في درجة حرارة الغرفة.

صب المحلول الزائد من الزجاجة سعة 50 مل في حاوية نفايات عضوية. أضف 10 مل من الأسيتون إلى الزجاجة ، واخلطها جيدا ، واسكبها تماما لإزالة أي APS غير متفاعلة والشوائب الأخرى. كرر هذه الخطوة مرتين.

انشر الأقراص الورقية على المنشفة الورقية وضعها في فرن 110 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد السماح للأقراص الورقية بالتبريد ، قم بتخزين الأقراص في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر في درجة حرارة الغرفة. استخدم التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه أو FTIR للتحقق من تطعيم مجموعات الأمين على ورق السليلوز المربع.

افتح برنامج التحليل الطيفي FTIR. انتقل إلى تهيئة القياس. اختر البيانات الموجودة أسفل المستطيلات وحدد النسبة المئوية للنفاذية لوضع القياس.

ثم اختر Happ-Genzel للتعديل ، واضبط 45 لعدد عمليات المسح ، و 4.0 للدقة ، واضبط النطاق على أنه 400 كحد أدنى إلى 4000 كحد أقصى. انقر على القياس، ثم حدد ملف البيانات لبيانات الخلفية. انقر فوق BKG للحصول على خط الأساس للخلفية.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الورق المربع على حامل عينة الفيلم. ثم حدد ملف البيانات للبيانات النموذجية وانقر فوق العينة للحصول على الطيف الترددي للعينة. أغلق تطبيق التحليل الطيفي FTIR وقم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر.

أضف خمسة ملليلتر من محلول الجلوتارالديهايد 0.05٪ إلى زجاجة زجاجية سعة 20 مل. اغمر 15 قرصا من أقراص الترشيح ذات التدفق المتوسط في هذا المحلول واحتفظ بها لمدة ساعة واحدة مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة. في الوقت نفسه، كرر هذه الخطوة لإعداد 15 قرصا آخر من ورق الترشيح سريع التدفق يعمل بالألدهيد.

لإزالة الجلوتارالديهايد غير المتفاعل من الأقراص الورقية، ضع أولا أقراص ورق الترشيح متوسطة التدفق وأقراص ورق الترشيح سريع التدفق في أنابيب منفصلة لأجهزة الطرد المركزي سعة 15 ملليلترا. ثم أضف خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل أنبوب وقم بهز الأنابيب لمدة 10 ثوان. قم بإزالة الماء عن طريق الشفط باستخدام ماصة.

كرر مرتين لإزالة أي جلوتارالديهايد غير متفاعل. ثم جفف الأقراص الورقية في فرن 37 درجة مئوية. بمجرد أن يجف ، أضف خمسة ميكرولترات من 0.025 ملليغرام لكل مليلتر من الأجسام المضادة لشظية IgG Fc إلى أقراص ورق الترشيح ذات التدفق المتوسط وثمانية ميكرولترات إلى أقراص ورق الترشيح سريعة التدفق.

بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة ، أضف 10 ميكرولترات من 50 ملي مولار PBS pH 7.4 إلى كل قرص ورقي دون إزالة الأجسام المضادة. احتضن لمدة 40 دقيقة لتفاعل ألدهيد الأمين. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية.

كرر الغسيل ثلاث مرات. بعد تجفيف الأقراص الورقية في فرن على حرارة 37 درجة مئوية ، قم بسد الأقراص الورقية ب 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للحجب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل كل قرص ورقي ب 0.2 مل من عازلة الغسيل فوق منشفة ورقية.

كرر الغسيل ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتشغيل معايير IgG. قم بتحميل 10 ميكرولترات من تركيزات IgG المختلفة على أقراص فردية في ثلاث نسخ.

احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.

بعد الغسيل، قم بتحميل 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة لجزء الفأر المترافق HRP IgG Fc واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقراص الورقية ب 0.2 مل من مخزن الغسيل فوق منشفة ورقية. كرر الغسيل ثلاث مرات.

أخيرا ، قم بتحميل خليط 10 ميكرولتر من TMB وبيروكسيد الهيدروجين على كل قرص. التقط صورا لجميع الأقراص الورقية بكاميرا رقمية أو هاتف ذكي بعد خمس دقائق من الحضانة وقم بتحليلها كما هو موضح في بروتوكول النص. يظهر هنا أطياف FTIR لورق الترشيح متوسط التدفق غير المعالج والمعالج ب APS وورق الترشيح سريع التدفق.

أظهرت الزيادة في الشدة عند نطاقات 902 و 1 ، 170 سنتيمترا عكسيا و 1 ، 210 إلى 1 ، 500 سنتيمتر عكسي لورق الترشيح متوسط التدفق بالإضافة إلى القمم المميزة في نطاق 972 إلى 1 ، 180 سنتيمترا عكسيا لورق الترشيح سريع التدفق أن APS قد تم تطعيمه بنجاح على ورق السليلوز. تظهر هنا تأثيرات التركيزات المختلفة من الجلوتارالديهايد على تثبيت IgG FITC على الأقراص الورقية. التركيز الأمثل للجلوتارالديهايد هو 0.05٪ وبالمثل ، يتم عرض تأثيرات التركيزات المختلفة من IgG FITC على تثبيت IgG FITC على الأقراص الورقية.

تؤدي زيادة حمل وتركيز IgG FITC إلى زيادة كمية IgG FITC المجمدة على الأقراص الورقية. ومع ذلك ، فإن زيادة تركيز IgG FITC الثابت لا يحسن قدرة الارتباط بالمستضد. تظهر هنا منحنيات المعايرة لتحديد IgG بواسطة ELISA الورقية.

تم الكشف عن الأجسام المضادة بتركيز نانوغرام واحد لكل مليلتر IgG بالعين المجردة باستخدام هذا الفحص الورقي. كان لتركيز مصل IgG علاقة خطية مع كثافة القياس اللوني من صفر إلى 500 نانوجرام لكل مليلتر عندما تم تحضين كل خطوة لمدة ساعة واحدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت الأجسام المضادة على المصفوفة الخلوية لتطوير المقايسات المناعية.

خطرت لنا الفكرة لأول مرة عندما كنا نطور فحوصات تشخيصية منخفضة التكلفة ذات حساسية محدودة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تشخيص نقاط الرعاية لاستكشاف تطوير اختبارات تشخيصية منخفضة التكلفة في الموقع لمسببات الأمراض المختلفة.