العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعات الخلايا المفردة من مقصورات الأمعاء الدقيقة المختلفة التي يمكن استخدامها لاحقا لتحليل قياس التدفق الخلوي أو وسيلة بديلة للتوصيف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة المخاطية مثل كيفية تأثير الجراثيم على نمو الجهاز المناعي المعوي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها سريعة وقابلة للتكرار ولا تتطلب تدرجات بيركول شاقة.

لبدء هذا الإجراء ، ضع الجانب الظهري للفأر لأسفل ورش البطن بنسبة 70 في المائة من الإيثانول ، وقم بإجراء شق البطن عن طريق قطع الجلد بالتتابع ثم اللفافة البريتونية على طول خط الوسط البطني من ارتفاق العانة إلى عملية الخنجري ، وبالتالي تعريض التجويف البريتوني. بعد ذلك ، افصل الأمعاء الدقيقة عن المعدة عن طريق تمرير العضلة العاصرة البوابية. قم بإزالة الأمعاء الدقيقة برفق من الصفاق وإزالة الدهون المساريقية.

لإزالة الأمعاء الدقيقة بالكامل ، قم بإجراء قطع ثان عند تقاطع اللفائف. ضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في وسط أربع درجات مئوية RPMI يحتوي على 10 بالمائة FBS لزيادة صلاحية الخلية. قم بإزالة القطع الكبيرة من الدهون برفق باستخدام ملقط منحني وتوخي الحذر لتجنب تمزق أنسجة الأمعاء نفسها أثناء العملية.

لإزالة محتويات الأمعاء ، قم بتقطيع الطرف القريب من الأمعاء الدقيقة بإبرة تغذية عيار 18 مثبتة على حقنة وقم بغسل الأمعاء برفق ب 15 إلى 20 مل من PBS البارد. استخدم المقص لاستئصال بقع باير الموجودة على الجانب المعوي من الأمعاء الدقيقة وتظهر ككتلة بيضاء متعددة الفصوصات. ثم ضعها في وسط RPMI بارد يحتوي على خمسة بالمائة FBS.

بعد ذلك ، قم بتقطيع الأمعاء الدقيقة إلى شرائح من ثلاث إلى أربع بوصات ، وقم بإزالة الدهون المتبقية عن طريق لف كل جزء معوي صغير على منشفة ورقية مبللة ب RPMI واستخدم مشرطا باهتا لإثارة الدهون بعيدا عن الأنسجة. يعد إيلاء اهتمام صارم للإزالة الكاملة للدهون المساريقية أمرا بالغ الأهمية لضمان بقاء الخلايا الليمفاوية حيث يمكن أن تتسبب القطع الصغيرة من الدهون في موت الخلايا. بعد ذلك ، اقلب الأنسجة من الداخل إلى الخارج عن طريق تقلية الأجزاء المعوية بملقط منحني وإمساك الطرف البعيد للأنسجة ، ثم استخدم زوجا من الملقط المستقيم لإزالة جزء الأنسجة برفق من الطرف القريب ، مما يؤدي إلى قلب الأنسجة.

ضع شرائح الأنسجة في كوب يحتوي على 30 مل من وسائط الاستخراج وشريط التقليب. ثبت الغطاء على الغطاء وحركه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يجب أن يكون التحريك قويا ، ولكن ليس مضطربا.

بعد 15 دقيقة ، استخدم مصفاة فولاذية لفصل قطع الأنسجة عن الظهارة التي تحتوي على مادة طافية والتي يجب أن تبدو غائمة. حرك قطع المناديل يدويا في وسط RPMI لغسل وسائط الاستخراج المتبقية. بعد ذلك ، ضع المنديل على منشفة ورقية جافة ، واقلبها عدة مرات لتسهيل إزالة المخاط المتبقي الذي لم يتم تحريره بواسطة وسط الاستخراج.

بعد ذلك ، ضع شظايا الأنسجة في أنبوب واحد خمسة ملليلتر مع 600 ميكرولتر من وسط الهضم. افرم المنديل حتى تختفي القطع بالمقص ويبدو المحلول متجانسا. هذه الخطوة ضرورية لضمان الهضم الأنزيمي الكامل للأنسجة.

يعد فرم الأنسجة حتى لا تلتصق القطع بالمقص ويبدو المحلول متجانسا أمرا بالغ الأهمية لضمان العائد الخلوي وكذلك ضمان استنساخ النتائج. أضيفي الأمعاء الدقيقة المفرومة إلى كوب يحتوي على 25 مل من وسائط الهضم وقلبي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في منتصف عملية الهضم ، قم بتثبيتها لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية للمساعدة في تكسير أي قطع كبيرة من الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بتصفية الأنسجة الهضمية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب سعة 15 ملليلترا. اشطف المصفاة ب 20 مل من وسط RPMI الذي يحتوي على 10 بالمائة FBS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول المصفى لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

صب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط RPMI الذي يحتوي على 10 بالمائة FBS. قم بتصفية الخلايا المعاد تعليقها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 15 مل. اشطف المصفاة ب 20 مل من RPMI التي تحتوي على 10 بالمائة FBS.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول المصفى لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط RPMI ، الذي يحتوي على اثنين بالمائة FBS. في هذا الإجراء ، انقل بقع Peyer's Patches المستأصلة إلى كوب به 25 مل من وسائط الهضم وشريط التقليب.

قم بتأمين الغطاء وتدويره لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتصفية بقع باير المهضومة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 15 مل. إذا بقيت أي كتل ، فاضغط عليها من خلال المصفاة باستخدام الطرف المسطح للمكبس من حقنة سعة مليلتر واحد.

ثم اشطف المصفاة ب 10 ملليلتر من وسط RPMI، الذي يحتوي على 10 بالمائة FBS. الطرد المركزي المحلول المصفى لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بصب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط RPMI الذي يحتوي على اثنين بالمائة FBS.

يجب أن ينتج عن تحليل قياس التدفق الخلوي لمعلقات الخلية المفردة للخلايا الليمفاوية المعوية الدقيقة مجموعة سرية من الخلايا التي لها خصائص تشتت أمامية وجانبية مماثلة لخلايا الطحال. قد تبدأ الخلايا الليمفاوية في الموت إذا لم يتم الحفاظ على الأنسجة عند أربع درجات مئوية خلال المراحل الأولى من العزل ، مما يؤدي إلى تشتت الخلايا الليمفاوية السفلية إلى الأمام ويصعب فصلها عن الخلايا الظهارية والميتة الأخرى. علاوة على ذلك ، إذا لم تتم إزالة الدهون المساريقية بالكامل من أنسجة الأمعاء الدقيقة ، فسيكون هناك فقدان كامل تقريبا للخلايا الليمفاوية.

عادة ، يتم الحصول على صلاحية 80 في المائة للخلايا الليمفاوية LP المعوية الدقيقة. بمجرد إتقانها ، يمكن للمرء معالجة أربعة فئران والحصول على معلقات أحادية الخلية جاهزة للتلطيخ في أقل من أربع ساعات. أثناء هذا الإجراء ، من المهم إزالة جميع دهون المساريقية تماما وفرم الأنسجة جيدا لضمان الهضم الكامل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام معلقات الخلية المفردة لأغراض أخرى غير قياس التدفق الخلوي ، مثل التجارب في المختبر أو تحليل التعبير الجيني أو النقل بالتبني لتوصيف وظيفة هذه الخلايا بشكل أكبر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم المناعة المخاطية لاستكشاف التطور والآثار الوظيفية لجهاز المناعة المعوي في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل معلقات الخلية المفردة من مقصورات الأمعاء الدقيقة المختلفة ، عن طريق تنظيف الدهون المساريقية ، واستخراج الطبقة الظهارية ، وهضم الأنسجة بالكولاجيناز.