بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف التقييم الوظيفي لمكتبات الطفرات الشاملة للتشبع في موقع واحد للبروتينات ، باستخدام تسلسل عالي الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الكيمياء الحيوية والتطور الجزيئي. مثل ، ما هي القيود الهيكلية والتطورية الكيميائية الحيوية على البروتينات؟

وكيف يمكننا هندسة البروتينات ذات الوظائف الجديدة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تزيد من عدد من قراءات التسلسل المفيدة في دراسة طفرات تشبع البروتين الكامل ، عن طريق تعدد بناء المكتبة وتسلسلها. بعد تحضير صفيحة من PCR Master Mix وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولتر من الألواح المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على بادئات الطفرات الحسية المخففة مسبقا إلى الآبار المتشابهة في ألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

استخدم مانع تسرب اللوحة لتغطية كل لوحة PCR ، وجهاز طرد مركزي عند 200 Gs لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، انقل لوحات PCR إلى جهاز تدوير حراري ، وقم بتشغيل البرنامج التالي. بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافي وتخفيف التفاعلات ، من واحد إلى 100 ، قم بنقل ميكرولتر واحد من منتجات PCR المطفرة في الجولة الأولى المختلطة والمخففة ، إلى الآبار المماثلة لألواح PCR الجديدة التي تحتوي على Master Mix.

استخدم ختم اللوحة لتغطية كل لوحة PCR. الطرد المركزي الألواح عند حوالي 200 Gs لمدة دقيقتين. ثم انقل اللوحات إلى جهاز التدوير الحراري ، وقم بتشغيل نفس البرنامج المدرج سابقا في الفيديو.

بعد التحقق من أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقياس التركيزات وفقا لبروتوكول النص ، قم بخلط 100 نانوجرام من كل منتج PCR لمكتبة NNS الفرعية في خمس مجموعات مكتبة فرعية NNS. بعد تشغيل تفاعلات PCR للمكتبة الفرعية وهضم متجهات الاستنساخ في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد تفاعلات الربط باتباع هذه الإرشادات لكل مجموعة مكتبة فرعية NNS مهضومة ، مع متجه الاستنساخ المهضوم للتقييد المماثل. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

بمجرد إذابة خلايا الإشريكية القولونية ذات الكفاءة الكهربائية ، أضف عشرة ميكرولترات من الخلايا إلى كل تفاعل ربط منقى ، وانقلها إلى كوفيت كهربائي. قم بكهربو الخلايا عند 1.8 كيلو فولت ، ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط SOB واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أعد تعليق 10 ميكرولتر من كل ثقافة استرداد في 990 ميكرولتر من LB. ونشر 100 ميكرولتر على ألواح المثقاب LB التي تحتوي على 12 ميكروغرام لكل مليلتر من التتراسيكلين.

لكل ثقافة استرداد ، قم بإعداد قارورة مزرعة سعة 250 مليلتر مع 50 مل من LB و 50 ميكرولتر من مخزون tet. انقل ما يقرب من ملليلتر واحد من ثقافة الاسترداد المتبقية إلى قارورة. احتضان عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.

بعد حساب عدد المحولات الناجحة على الألواح ، وعزل الحمض النووي للبلازما عن الثقافات الليلية ، امزج 100 نانوجرام من كل بلازميد. بعد تحويل مكتبة الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص ، قم بتخفيف ثقافة المكتبة بين عشية وضحاها إلى OD-600 يساوي 0.1. وأضف ملليلتر واحد إلى قارورة واحدة.

احتضان ثقافة الاختيار المسبق عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. راقب النمو بشكل دوري عن طريق قياس OD-600 ، حتى يساوي 0.1. انقل 100 مل من ثقافة الاختيار المسبق إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 4 ، 000 جم لمدة ست دقائق ، عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة معظم المادة الطافية وامزج الكريات في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا. ثم ، بعد تكرار الطرد المركزي ، قم بإزالة كل المادة الطافية. إلى القواريرتين الأخريين ، أضف التتراسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ 12 ميكروغرام لكل مليلتر.

وحجم ثقافة الاختيار المسبق ، بحيث يكون OD-600 النهائي يساوي 0.001. إلى قارورة واحدة ، أضف ملليلتر واحد من 50 ملليغرام لكل مليلتر أمبيسلين بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام لكل مليلتر. هذه هي ثقافة الاختيار.

أثناء احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة ، راقب نمو المزرعة التي لا تحتوي على أمبيسلين حتى تصل إلى OD-600 يساوي 0.1. قم أيضا بقياس OD-600 لثقافة الاختيار. بعد تقسيم OD-600 من ثقافة الاختيار إلى 0.1 ، والضرب في 100 ، انقل هذا الحجم إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي عند 4 ، 000 جي ثانية وأربع درجات مئوية لمدة ست دقائق.

بعد إزالة معظم المادة الطافية ، امزج الكريات في أنبوب واحد قبل الدوران مرة أخرى وإزالة كل المادة الطافية. لإجراء تسلسل عالي الإنتاجية ، قم بإعداد PCR Master Mix ونقل 23 ميكرولتر إلى 10 أنابيب PCR. أضف ميكرولتر واحد من 0.5 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد المنقى من ثقافة الاختيار المسبق إلى الأنابيب من واحد إلى خمسة.

ومن ثقافة الاختيار إلى الأنابيب من ستة إلى 10. امزج 50 ميكرولترا من 50 ميكروموليا من البادئات المتعامدة إلى الأمام ، OP1F إلى OP5F ، مع البادئات المتعامدة العكسية ، OP1R إلى OP5R. بنفس الترتيب ، قم بنقل ميكرولتر واحد إلى أنابيب PCR من واحد إلى خمسة ، ومن ستة إلى 10.

انقل أنابيب PCR إلى جهاز التدوير الحراري ، وقم بتشغيل البرنامج التالي. بعد ذلك ، قم بتخفيف تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل 100 مرة ، عن طريق نقل ميكرولتر واحد من كل أنبوب إلى 99 ميكرولتر من الماء. تخلط جيدا ، ثم ماصة 99 ميكرولتر من الأنابيب ، وتخلص منها.

امزج 50 ميكرولترا من الاشعال الأمامية والعكسية. بعد ذلك ، قم بنقل ميكرولتر واحد إلى أنابيب PCR من واحد إلى خمسة ، ومن ستة إلى 10. ثم ، بعد تحضير PCR Master Mix ، أضف 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR ، وقم بتشغيل البرنامج التالي.

لإجراء تفاعلات البوليميراز المتسلسل النهائية لإضافة تسلسلات الفهرسة ، بعد تخفيف تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل 100 ضعفا ، كما كان من قبل ، والاحتفاظ بميكرولتر واحد ، أضف 23 ميكرولترا من PCR Master Mix. بالنسبة للأنابيب ذات القالب الذي ينشأ من مجموعات مكتبة NNS الفرعية من واحد إلى خمسة ، أضف 0.5 ميكرولتر من البادئات الأمامية 501F إلى 505F ، على التوالي. بالنسبة للأنابيب ذات القالب الناتج عن ثقافات الاختيار والاختيار المسبق ، أضف 0.5 ميكرولتر من الاشعال العكسية 701R و 702R.

قم بتشغيل نفس برنامج PCR كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، بعد قياس تركيزات كل تفاعل وفقا لبروتوكول النص ، قم بخلط 100 نانوجرام من كل منتج من منتجات PCR في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد. بعد إضافة صبغة تحميل هلام 6X ، قم بتحميل عينة PCR الكاملة المدمجة على جل الاغاروز بنسبة 2 بالمائة.

وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة 50 دقيقة. باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي ، قم بتصور ، ثم استئصال الشريحة التي تحتوي على منتج PCR من حوالي 360 زوجا أساسيا. تنقية العينة وتسلسلها وتحليلها وفقا لبروتوكول النص.

هنا خريطة البلازميد للبلازميدات الخمسة المعدلة pBR322 التي تحتوي على مواقع فتيلة متعامدة. أظهر اختبار خصوصية البادئات المتعامدة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أنه تم الحصول على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الصحيح فقط عند تضمين البلازميد المطابق في التفاعل. ولم يتم الحصول على أي منتج من أي حجم في غيابه.

بعد معالجة التجربة ، تم الحصول على 6.2 مرات من 10 إلى القراءة السادسة من شرط الاختيار المسبق ، و 6.3 في 10 إلى القراءات السادسة من حالة الأمبيسلين. تظهر أعداد كل طفرة في الأحماض الأمينية من حالة الاختيار المسبق توزيعا طبيعيا. يصور هذا الشكل تأثير اللياقة النسبية ، FIA ، لكل طفرة في كل موضع من TEM-one.

وتوزيعه موضح هنا. تحت الاختيار عند 50 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين ، فإن معظم الطفرات لها تأثير لياقة محايدة أو شبه محايدة. يتوافق مع وحدات البكسل البيضاء هنا ، والذروة الكبيرة هنا.

جزء صغير من الطفرات في تركيز المضاد الحيوي هذا له تأثيرات كبيرة على اللياقة البدنية. كما هو متوقع ، تشمل هذه الطفرات داخل بقايا الموقع النشطة المحفوظة للغاية. في المقابل ، يظهر عدد قليل من وحدات البكسل باللون الأحمر بشكل ملحوظ.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوع تقريبا. إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، وتتوفر جميع الكواشف. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تظل منظما أثناء الاستنساخ لدمج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المطفرة في المجموعات الصحيحة ، والاستنساخ في النواقل الصحيحة.

وأثناء إعداد التسلسل ، لاستخدام الاشعال الصحيحة. تمتد من هذا الإجراء ، يمكن تعديل الخطوات الرئيسية للبروتوكول لفحص مجموعات الطفرات وبيئات الاختيار المختلفة وأنظمة البروتين الأخرى ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالاعتماد الجيني والبيئي على السياق للطفرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للعمل المطلوب لإنشاء مكتبة طفرات تشبع البروتين الكامل ، وتقييم التأثيرات الوظيفية لكل طفرة في وقت واحد ، باستخدام تسلسل عالي الإنتاجية.

لا تنس أن العمل مع بروميد الإيثيديوم والأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات ومعطف المختبر ودرع الأشعة فوق البنفسجية أثناء تنفيذ أجزاء من هذا البروتوكول.