تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور نقل الطاقة من خيط DNA معدل صبغة إلى آخر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية. مثل تداخل الحمض النووي الريبي من خلال مراقبة معالجة الحمض النووي الريبي وسلامته في الخلايا الحية في الوقت الفعلي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، هي سهولة مراقبة الإزهار وتغيير اللون ، مما يعطي نتيجة واضحة. لذلك يتم التخلص من النتائج الإيجابية الخاطئة. ابدأ هذا الإجراء ، أضف الكواشف المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص إلى قارورة قاع مستديرة سعة 20 مليلتر ، ومجهزة بشريط تحريك مغناطيسي ومكثف ارتجاع.

ثم أضف نقطة صفر صفر ستة ملليلتر من البيبيريدين. وسخني خليط التفاعل إلى 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد أن يبرد التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة ، اجمع الراسب الناتج عن طريق الترشيح.

واغسلها بثنائي إيثيل الأثير ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف مائة مل من ثنائي إيثيل الأثير إلى المادة الطافية. وجمع الراسب الناتج عن طريق الترشيح.

بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام ثنائي إيثيل الأثير ، امزج الراسب مع المواد الصلبة المعزولة من الترشيح الأول. باستخدام الكمبيوتر ، المتصل بمركب الحمض النووي ، أدخل تسلسل الحمض النووي المطلوب وطريقة الاقتران. اتباع التعليمات الواردة من بروتوكول الشركة المصنعة.

بعد ذلك ، قم بتركيب العمود الذي يحتوي على زجاج الصب المتحكم فيه ، والذي يتم تعديله بشامة صغيرة واحدة من الوجه الأول في المركب. الآن ، ابدأ التوليف على مركب الحمض النووي. بعد عمل خيوط الحمض النووي ، أضف الحكام المناسبين كما هو موضح في بروتوكول النص إلى عينة الحمض النووي المعدلة من الألكين ثنائي الإيثيل.

احتضان العينة عند 60 درجة مئوية لمدة نقطة واحدة وخمس ساعات. ثم انقل العينة إلى أنبوب سعة 10 ملليلتر. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 150 ميكرولترا ، من محلول ملح ثنائي الصوديوم EDTA بنقطة صفر صفر خمسة مولار ، و 450 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم ثلاثي المولار إلى عينة الحمض النووي.

بعد ذلك ، أضف 10 مل من الإيثانول إلى العينة. واحتفظ بها عند 32 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 16 ساعة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة بألف مرة G. عند الانتهاء ، قم بإزالة المادة الطافية.

اغسل حبيبات الحمض النووي الناتجة بملليلترين من الإيثانول البارد بنسبة 80٪. ثم جفف الحبيبات تحت ضغط منخفض باستخدام مجفف التجميد. تنقية حبيبات الحمض النووي الخام بواسطة HP LC.Monitor التشغيل عن طريق التحقق من 260 نانومتر و 459 نانومتر لصبغ واحد.

أو 542 نانومتر للصبغ الثاني. اجمع الكسور التي تظهر الامتصاص في كلتا قناتي طول الموجة. لقياسات التحليل الطيفي لامتصاص خيط واحد ، سجل قياسا فارغا يحتوي فقط على 200 مللي مولار كلوريد الصوديوم و 50 ملليمولار من فوسفات الصوديوم.

بعد ذلك ، انقل محلول DNA1 المعد مسبقا إلى كوفيت زجاجي كوارتز. سجل الامتصاص. ثم حدد القيمة القصوى لامتصاص الصبغة.

بالنسبة لقياسات التحليل الطيفي الفلوري أحادي الخيط ، سجل قياسا فارغا يحتوي فقط على 200 مللي مولار كلوريد الصوديوم و 50 مللي مولار فوسفات الصوديوم ، باستخدام طول موجة الإثارة ل Dye one. بعد ذلك ، ضع الكوفيت مع محلول DNA1 في مقياس الطيف. سجل طيف الإزهار.

لإجراء قياس التحليل الطيفي الفلوري للخيط المزدوج ، ضع الكوفيت مع الخيط المزدوج لمحلول DNA1 و DNA2 في مقياس الطيف. ثم سجل طيف الفلورسنت باستخدام طول موجة الإثارة لصبغ واحد. للحصول على فهم أفضل لما تظهره الأطياف المسجلة ، قم بإشعاع الكوفيتات بمصابيح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة باليد.

لاحظ التغيير في لون الإزهار من الحمض النووي الفردي إلى الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. تظهر أطياف الامتصاص المسجلة الحد الأقصى عند 465 نانومتر للحمض النووي أحادي الشريطة1 و 546 نانومتر للحمض النووي أحادي الشريطة2. يظهر الخيط المزدوج الملدن من DNA1 و DNA2 الحد الأقصى عند 469 و 567 نانومتر.

يظهر كل من الامتصاص الأقصى تحولا باثاوهروميك. وأصغر التغييرات الطيفية هي نتيجة التفاعلات المثيرة بين الأصباغ داخل بنية الحمض النووي الحلزونية المزدوجة. تظهر الأطياف الفلورية المقابلة الحد الأقصى عند 537 نانومتر للحمض النووي أحادي الشريطة1.

عند 607 نانومتر للحمض النووي أحادي الشريطة2. وعند 615 نانومتر للحبلا الصلب المزدوج من الحمض النووي 1 و DNA2. يظهر تقطعت بهم السبل المزدوجة من DNA1 و DNA2 فقط الحد الأقصى للانبعاث من صبغة اثنان ، على الرغم من أن صبغة واحدة متحمسة بشكل انتقائي ، مما يدل على أن نقل الطاقة يحدث بكفاءة من صبغة واحدة إلى صبغة اثنين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نشر تعديل الحمض النووي صناعيا عن طريق تفاعل تحفيزي زوجين لخيط DNA المسمى الألكاين مع جانب A.