Name: تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: اكتشف تخليق رنا صغير مُعدّل بـ2'-ألكاين ووضع علامات عليه بأصباغ سيانين صامدة للضوء لمراقبة التهجين الحمض النووي عبر تغير اللون الفلوري في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الدعم المالي من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، وا 1386 / 17-1)، والتدريب البحثي المجموعة GRK 2039 (التي تمولها DFG) وKIT ما قدمه من مساعدة.

<ol><li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%3B%3A+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">#34;DNA Traffic Lights&#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%3A+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA &#34;Traffic Lights&#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li>
<li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li>
<li>Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+%26%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &#34;DNA Traffic Lights&#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li>
<li>Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li>
<li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%2C+Volume+1%3A+Nucleic+Acids%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids</a>. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).</li>
<li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbance+melting+curves+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li>
<li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Dimers%3A+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li>
<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

<html> ويظهر هذا البروتوكول الإجراء الكامل لتسمية الحمض النووي بعد صناعي عبر CuAAC بواسطة الأصباغ الفلورية المعدلة أزيد. وهذا يشمل تركيب الأصباغ والحمض النووي المعدلة آلكاين فضلا عن إجراءات وضع العلامات. تركيب الأصباغ يتبع أربع خطوات. جميع المنتجات التي يمكن الحصول عليها من قبل هطول الأمطار بسيطة إلى حد ما بسبب شحنة موجبة، وليس هناك حاجة إلى تستغرق وقتا طويلا العمود اللوني. إدخال وظائف أزيد قبل الخطوات اقتران المر...

يمثل التصوير الجزيئي تقنية أساسية لفهم العمليات البيولوجية داخل الخلايا الحية. 1-3 تطوير تحقيقات الفلورسنت الحمض النووي على أساس لمثل هذه التطبيقات الكيميائية البيولوجية أصبح حقل البحوث التوسع. وتحتاج هذه تحقيقات الفلورسنت لتلبية بعض المتطلبات لتصبح أدوات مناسبة لتصوير الخلايا. أولا، يجب أن الأصباغ تطبيقها تظهر مضان ذات العوائد العالية الكم، والتحولات الكبيرة ستوكس، والأهم من ذلك، photostabilities مرتفعة للسماح طويلة الأجل في مجال التصوير الجسم الحي. وثانيا، ينبغي أن تظهر قراءات مضان يمكن الاعتماد عليها. وتعتمد أنظمة حامل اللون-فاكهه تقضي التقليدية على قراءات من لون مضان واحد عن طريق تغييرات بسيطة في كثافة مضان. 4 هذا النهج يحمل خطر من النتائج السلبية الإيجابية أو كاذبة كاذبة بسبب تألق ذاتي من مكونات داخل الخلايا أو انخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التبريد غير مرغوب فيه من قبل شركات أخرى لponents 4 بلغنا مؤخرا على مفهوم &quot;إشارات المرور الحمض النووي&quot; التي تظهر مزدوجة قراءات اللون مضان باستخدام اثنين من حاملات مختلفة. 5-6 ويستند مفهوم على نقل الطاقة (ET) من الصبغة المانحة إلى صبغ متقبل الذي يتغير مضان اللون (انظر الشكل 1). هذا يسمح للقراءات أكثر موثوقية، وبالتالي يوفر أداة قوية لتحقيقات التصوير الفلورسنت. وضع البطاقات التعريفية على أليغنوكليوتيد مع الأصباغ الفلورية يمكن أن يتحقق من خلال نهجين مختلفين. ويمكن إدراج الأصباغ خلال توليف الحمض النووي الكيميائي في مرحلة الصلبة باستخدام كتل بناء phosphoramidite تعديل تبعا لذلك. 7 يقتصر هذا الأسلوب إلى الأصباغ التي هي مستقرة في ظل phosphoramidite وdeprotection الظروف القياسية. وكبديل لذلك، تم إنشاء منهجيات تعديل آخر الاصطناعية في الكيمياء النوكليوتيد. هنا، علينا أن نظهر تركيب واحدة من الصور الجديدةالطاقة الجدول نقل أزواج 8،9 ووضع العلامات آخر الاصطناعية من الحمض النووي باستخدام المحفز النحاس 1،3-cycloaddition بين أزيدات والألكاينات (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan = "4" ><قوي>synthesis</td>4-Picoline</tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1،3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC الصف</td></tr><tr><td>خلات الإيثيل</td><td>فيشر العلمية</td><td>10456870</td><td>الصف التقني</td></tr><tr><td>أزيد</td> <td>الصوديومسيجما ألدريتش</td><td>71290</td><td>سنويا الصف</td></tr><tr><td>ثنائي كلورو ميثان</td><td>فيشر العلمي</td><td>10626642</td><td>الدرجة التقنية</td></tr><tr><td>إندول -3-كربوكسالديهايد. 98٪</td> <td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>كربونات البوتاسيوم ، 99 + ٪</td> <td>أكروس</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل كربونات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>517127</td><td></td></tr> <tr><td>< م > ن ، ن < م > ثنائي ميثيل فورماميد ، 99.8٪ ، جاف جدا فوق المنخل الجزيئي</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الصوديوم</td><td>بيرند كرافت</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول ، 99.5٪</td> <td>أكروس</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>بيبيريدين ، 99٪</td> <td>أكروس</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل إيثر</td><td>فيشر 10407830 العلمية</td><td></td><td>من الدرجة التقنية</td></tr><tr><td>2-فينيليندول -3-كربوكسالديهايد ؛ 97٪</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-ميثيل كينولين</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي > تخليق الحمض النووي < / قوي ></td></tr> <tr><td>سريع 8909 مركب الحمض النووي</td><td>الأنظمة الحيوية التطبيقية</td> <td>&nbsp ؛ -</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA (bz) الفوسفوراميديت</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT فوسفوراميديت</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG (dmf) الفوسفوراميديت</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC (bz) الفوسفوراميديت</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>مخفف أميديت لتخليق الحمض النووي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>أسيتونيتريل فائق النقاء لتخليق الحمض النووي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>كاب أ</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>كاب ب</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT العمود 1.0&nbsp; ومايكرو. </td><td>كواشف الخلد Proligo</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) العمود 1.0&nbsp; ومايكرو. </td><td>كواشف الخلد Proligo</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) العمود 1.0&nbsp; ومايكرو. </td><td>كواشف الخلد Proligo</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC (bz) العمود 1.0 &nbsp ؛ ومايكرو. </td><td>كواشف الخلد Proligo</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>الأمونيا (محلول مائي) &nbsp;</td>أجهزة الطرد المركزي <td>318612</td><td></td> <td>التحليلية من Fluka</td></tr><tr><td>nanosep 0.45&nbsp; ومايكرو. م</td><td>بال</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5- (بنزيلثيو) -1H-tetrazole (المنشط)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>الجينات الكيميائية</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr> <td colspan = "4" ><قوي >workup < / قوي ></td></tr> <tr><td>فراغ مكثف</td><td>المسيح</td><td></td><td></td></tr> <tr><td><قوي > انقر فوق إجراء < / قوي> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>رباعي (أسيتونيتريل) النحاس (I) سداسي فلورو فوسفات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S2889</td><td></td></tr> <tr><td>(+) - الصوديوم L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ملح ثنائي الصوديوم</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>تم تصنيعه وفقا لإجراء الأدبيات 1 </td></tr><tr> < td colspan = "4" >HPLC </td></tr><tr><td>HPLC نظام</td><td>مطياف Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV</td><td>بروكر دالتونيكس</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 عمود</td><td>Supelcosil عبر Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr> <tr><td colspan = "4" > تحديد التركيز</ قوي ></td></tr> <tr><td>ND 1000 مقياس الطيف</td><td>الضوئي nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4" >< قوي > تحضير العينة والتحليل الطيفي < / قوي ></td></tr> <tr><td>كاري 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3</td><td>مقياس الفلور Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr> <tr>< td colspan = "4" >1 R. Chan Timothy ، R. Hilgraf ، K. B. Sharpless ، V. Fokin Valery ، Org Lett 2004 ، 6 ، 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد cyanine الأصباغ

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتركيب 2&#39;-آلكاين تعديل النووي الريبي منقوص الأكسجين حامض (DNA) خيوط من قبل الآلي توليف المرحلة الصلبة باستخدام الكيمياء phosphoramidite القياسية. وصفت [أليغنوكليوتيد ما بعد صناعي من قبل اثنين من cyanine الأصباغ صامد جديدة باستخدام المحفز النحاس النقر الكيمياء. ووصف تركيب كل من الجهات المانحة ومتقبل صبغ ويتم تنفيذ في ثلاث خطوات متتالية. مع الحمض النووي كما أن الهيكل المحيطة بها، وهذه الأصباغ اثنين من الخضوع لنقل الطاقة عندما يتم تقديمهم الى مقربة من التهجين. لذلك، هو تصور الصلب اثنين واحد جدائل الحمض النووي تقطعت بهم السبل بسبب تغيير اللون مضان. يتميز هذا التغيير اللون عن طريق التحليل الطيفي مضان ولكن يمكن أيضا أن نلاحظ مباشرة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة (الأشعة فوق البنفسجية). مفهوم مزدوج قراءات اللون مضان يجعل هذه التحقيقات النوكليوتيد أدوات ممتازة للتصوير الجزيئي خصوصا عندما هواتف وصفهوتستخدم الأصباغ tostable. وبالتالي، يتم منع photobleaching من لتحقيقات التصوير، والعمليات البيولوجية يمكن ملاحظتها في الوقت الحقيقي لفترة زمنية أطول.

وتسجل امتصاص ومضان أطياف من الحمض النووي مفردة ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل كما هو مبين في الشكل (4). أطياف الامتصاص سجلت (الشكل 4 يمين) تظهر امتصاص ماكسيما λ كحد أقصى في 465 نانومتر لDNA1 احد الذين تقطعت بهم السبل (صبغ 1) و 546 نانومتر للDNA2 احد الذين تقطعت بهم السبل (صبغ 2). وDNA1_2 صلب (صبغ 1 &amp; ...

يتم توصيل أصباغ السيانين المستقرة ضوئيا بقليل النوكليوتيدات لمراقبة التهجين عن طريق نقل الطاقة.

تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور انتقال الطاقة من شريط DNA معدل بصبغة إلى شريط آخر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية، مثل تداخل RNA من خلال مراقبة معالجة siRNA وسلامته في الخلايا الحية في الوقت الفعلي.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في سهولة مراقبة مدى الفلورة وتغير اللون، مما يعطي نتيجة واضحة، وبالتالي يتم استبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة. لبدء هذا الإجراء، أضف الكواشف المناسبة كما هو موضح في البروتوكول النصي إلى دورق مستدير القاع سعة 20 milliliter، مجهز بقضيب تحريك مغناطيسي ومكثف ارتجاعي.بعد ذلك، أضف 0.06 مل من piperidine. وسخّن خليط التفاعل عند 80 °C لمدة أربع ساعات. وبعد أن يبرد التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة، اجمع الراسب الناتج عن طريق الترشيح.ثم اغسل باستخدام diethyl ether ثلاث مرات. بعد ذلك، أضف 100 milliliters من diethyl ether إلى الطافي. واجمع الراسب الناتج عن طريق الترشيح.بعد الغسل ثلاث مرات باستخدام diethyl ether، ادمج الراسب مع المادة الصلبة المعزولة من عملية الترشيح الأولى. وباستخدام الكمبيوتر المتصل بجهاز تخليق الحمض النووي DNA، أدخل تسلسل DNA المطلوب وطريقة الربط، متبعاً الإرشادات الواردة في بروتوكول الشركة المصنعة.بعد ذلك، قم بتركيب العمود الذي يحتوي على زجاج الصب المتحكم به، والمعدل بميكرومول واحد من الوجه الأول، في جهاز التركيب. الآن، ابدأ عملية التركيب باستخدام جهاز تركيب DNA. وبعد معالجة خيوط DNA، أضف الكواشف المناسبة كما هو موضح في البروتوكول النصي إلى عينة DNA المعدلة بـ diethylized alkyne.قم بتحضين العينة عند 60 °C لمدة 1.5 ساعة. ثم انقل العينة إلى أنبوب سعة 10 mL. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، أضف 150 µL من محلول EDTA disodium salt بتركيز 0.05 M، و450 µL من محلول sodium acetate بتركيز 0.3 M إلى عينة DNA.بعد ذلك، أضف 10 milliliters من الإيثانول إلى العينة. واحفظها عند درجة حرارة -32 °C لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، قم بطرد العينة مركزياً لمدة 15 دقيقة عند 1000 ×g. وعند الانتهاء، قم بإزالة الراشح.اغسل كتلة DNA الناتجة بملليلترين من الإيثانول البارد بتركيز 80%. ثم جفف الكتلة تحت ضغط منخفض باستخدام مجفف بالتجميد. قم بتنقية كتلة DNA الخام بواسطة HP LC. راقب عملية التشغيل من خلال فحص 260 nanometers، و 459 nanometers لـ Dye one.أو 542 نانومتر للصبغة الثانية. يتم جمع الأجزاء التي تظهر امتصاصاً في كلتا قناتي الطول الموجي. بالنسبة لقياسات مطيافية الامتصاص للشريط المفرد، يتم تسجيل قياس للمحلول الخالي (blank) الذي يحتوي فقط على 200 millimolar من كلوريد الصوديوم و 50 millimolar من محلول منظم فوسفات الصوديوم.بعد ذلك، انقل محلول DNA1 الذي تم تحضيره مسبقاً إلى كيوفيت من زجاج الكوارتز بطول واحد سنتيمتر. سجل قيمة الامتصاص، ثم حدد القيمة القصوى لامتصاص الصبغة.لإجراء قياسات مطيافية الفلورة لشريط واحد، قم بتسجيل قياس للعينة الفارغة (blank) التي تحتوي فقط على 200 millimolar من كلوريد الصوديوم و 50 millimolar من فوسفات الصوديوم، باستخدام طول موجة الإثارة الخاص بـ Dye one. بعد ذلك، ضع الكيوفيت المحتوي على محلول DNA1 في المطياف. ثم قم بتسجيل طيف الفلورة.لإجراء قياس مطيافية الفلورة للشريط المزدوج، ضع الكيوفيت التي تحتوي على محلول الشريط المزدوج من DNA1 وDNA2 في جهاز المطياف. ثم سجل طيف الفلورة باستخدام طول موجة الإثارة الخاص بـ Dye one. وللحصول على فهم أفضل لما تظهره الأطياف المسجلة، قم بتسليط مصابيح UV محمولة يدويًا على الكيوفيتات.لاحظ التغير في لون الفلورة عند التحول من الحمض النووي DNA أحادي السلسلة إلى ثنائي السلسلة. تُظهر أطياف الامتصاص المسجلة القمم القصوى عند 465 nanometers لـ DNA1 أحادي السلسلة و 546 nanometers لـ DNA2 أحادي السلسلة. أما السلسلة المزدوجة الملدنة من DNA1 و DNA2 فتُظهر قممًا قصوى عند كل من 469 و 567 nanometers.يظهر كلا الحدين الأقصويين للامتصاص إزاحة باثوكرومية (إزاحة نحو الأحمر). وتنتج أصغر التغيرات الطيفية عن التفاعلات الإكسيتونية بين الأصباغ ضمن بنية DNA الحلزونية المزدوجة. وتظهر أطياف الفلورة المقابلة حدًا أقصى عند 537 نانومتر لـ DNA1 أحادي السلسلة.عند 607 نانومتر للحمض النووي DNA2 أحادي الخيط. وعند 615 نانومتر للحمض النووي DNA1 وDNA2 مزدوج الخيط المترابط. ويُظهر الحمض النووي مزدوج الخيط DNA1 وDNA2 الحد الأقصى لانبعاث الصبغة Dye two فقط، على الرغم من استثارة الصبغة Dye one بشكل انتقائي، مما يثبت حدوث نقل الطاقة بكفاءة من الصبغة Dye one إلى الصبغة Dye two.بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تعديل الحمض النووي DNA اصطناعيًا من خلال تفاعل حفزي مزدوج لشريط DNA موسوم بالألكاين مع طرف A.

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو هو تظاهرة فنية للبروتوكول لتهجين كامل الجينوم تبليط الطريق CGH الصفيف ، الذي مسح الجينوم البشري بأكمله فقط باستخدام 25-100 نانوغرام من الحمض النووي يمكن أن يكون معزولا عن مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك المواد الأرشيفية الثابتة الفورمالين.

تظاهرة فنية من الجامعة التهجين الجينومي المقارن صفيف الجينوم

نقدم الرواية والتكامل قوية من nanophotonics (QD - الحنق) و microfluidics للتحقيق في تشكيل polyplexes polyelectrolyte ، والتي من المتوقع أن يوفر سيطرة أفضل وتوليف polyplexes موحدة وقابلة للحمض النووي في المستقبل على أساس المداواة.

الجمع بين QD - الحنق و microfluidics الحمض النووي لرصد Nanocomplex الذاتي الجمعية في الوقت الحقيقي

يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع...

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

يوضح الفيديو طريقة لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية باستخدام جزيئات الذهب النانوية المثبتة على البولي إيثيلين جلايكول ومجسات توتر دبوس الشعر في الحمض النووي. تؤدي تفاعلات الخلايا التائية الإيجابية CD8 إلى ظهور المسبار ، مما يؤدي إلى انبعاث مضان بينما يحافظ قفل الخيوط على الإشارة لتحديد القوى التي تطبقها الخلايا المناعية.

استخدام مجسات التوتر القائمة على الحمض النووي لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية

نحن تصف بروتوكول قوية وتنوعا لتحليل العمارة النووي DNA من قبل الأسماك 3D باستخدام تحقيقات الفلورسنت صفت مباشرة.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

هنا ، نقدم طريقة بسيطة لإجراء التهجين الموضعي للحمض النووي الفلوري (DNA ISH) لتصور التسلسلات غير المتجانسة المتكررة على الكروموسومات المثبتة على الشريحة. تتطلب الطريقة الحد الأدنى من الكواشف وهي متعددة الاستخدامات للاستخدام مع المجسات القصيرة أو الطويلة ، والأنسجة المختلفة ، والكشف عن الإشارات الفلورية أو غير الفلورية.

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

نقدم هنا، بروتوكول لاستخدامه thiazole البرتقالي للكشف عن الحمض النووي في جل التجارب التفريد. يسمح استخدام اللون البرتقالي thiazole القضاء اثيديوم بروميد، ويمكن أن يتحقق الأسفار الكشف بالأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق.

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

يصف هذا البروتوكول تطبيق الفلورو جزيء واحد في التهجين الموقعي (smFISH) لقياس حركية المير النووي في الجسم الحي من التوليف والتحلل.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لاستخدام مجسات التوتر القائمة على الحمض النووي لتصوير قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية. يمكن لهذا النهج تعيين قوى المستقبلات &gt;4.7pN في الوقت الفعلي ويمكنه دمج القوى بمرور الوقت.

مجسات توتر الحمض النووي لرسم خريطة لقوى مستقبلات بيكونيوتن العابرة بواسطة الخلايا المناعية

يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.

مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل

اكتشف تخليق رنا صغير مُعدّل بـ2'-ألكاين ووضع علامات عليه بأصباغ سيانين صامدة للضوء لمراقبة التهجين الحمض النووي عبر تغير اللون الفلوري في الوقت الفعلي.

تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ

استكشف المزيد من الفيديوهات