الوقاية من الإجهاد الحراري الآثار السلبية في الجرذان التي كتبها الانفعال

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم التأثير الوقائي لسلالة B.subtilis BSB3 ضد المضاعفات بعد الإجهاد الحراري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الوقاية من الآثار الضارة من الإجهاد الحراري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتقييم الأساليب المختلفة للتخفيف من مضاعفات الإجهاد الحراري.

وسيتم توضيح هذا الإجراء لودميلا جلوبا. وأوليغ بوسوفي ، باحث مشارك من مختبرنا. بادئ ذي بدء ، مع مستعمرة واحدة من Bacillus subtilis BSB3 التي نمت بين عشية وضحاها على طبق أجار مغذي.

تلقيح عشرة ملليلتر من مرق المغذيات في قارورة. قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. تحضير 500 مل من وسط الأبواغ حسب الوصفة الموضحة هنا.

والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اترك الوسط يبرد إلى 50 درجة مئوية قبل إضافة المحاليل المعقمة التالية. في خزانة معقمة ، قم بتبريد الوسط المحضر في درجة حرارة الغرفة إلى 40 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

واسكب 25 مل في كل من 20 طبق بتري معقم. دع الوسط يتصلب طوال الليل. بعد ذلك ، انشر 0.5 مل من ثقافة Bacillus subtilis BSB3 الليلية على سطح الألواح المتوسطة الأبواغ.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام حتى 90٪ من الأبواغ. ثم استخدم الفحص المجهري عالي الدقة للتحقق من وجود جراثيم ساطعة الطور. لحصاد البكتيريا ، أضف ملليلترا واحدا من PBS إلى الألواح ، واستخدم موزعا معقما للخلايا لكشط البكتيريا من السطح.

قم بتخزين التعليق على أربع درجات مئوية لحين الحاجة. تأكد من صلاحية البكتيريا عن طريق طلاء 0.1 ملليلتر من التخفيف المناسب للتعليق البكتيري على ألواح متوسطة الأبواغ واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. استخدم عداد المستعمرات لحساب المستعمرات البكتيرية وحساب عيار البكتيريا في المعلق الذي تم اختباره.

ثم قم بإعداد معلق بكتيري في PBS بتركيز نهائي واحد في عشرة إلى ثماني CFUs لكل مليلتر. بعد علاج الفئران عن طريق التزقيم الفموي باستخدام B.subtilis BSB3 أو PBS لمدة يومين ، ثم تقسيم وقياس درجة حرارتها ، احتفظ بالفئران من المجموعتين الأولى والثانية في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. ضع من المجموعتين الثالثة والرابعة في غرفة مناخية عند 45 درجة مئوية و 55٪ رطوبة نسبية لمدة 25 دقيقة.

بعد قياس درجات حرارة المستقيم لكل فأر مرة أخرى ، ضع جميع في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، بعد القتل الرحيم للحيوانات ، وجمع دم الجذع ، وعزل الأعضاء وفقا لبروتوكول النص ، ضع كل عينة من الأعضاء في أنابيب معقمة موزونة مسبقا ووزنها. أضف PBS معقما إلى كل أنبوب للحصول على وزن واحد إلى عشرة لكل تخفيف حجمي للعينة ، واستخدم مجانس الأنسجة الزجاجية المعقم لتوليد معلقات أنسجة متجانسة.

بعد ذلك ، استخدم PBS المعقم لعمل تخفيفات تسلسلية لكل عينة. ثم ضع 0.1 مل من جميع التخفيفات على سطح MacConkeys و 5٪ أجار الدم. وبروسيلا أجار الدم مع هيمين وفيتامين ك 1. بعد احتضان الألواح ، استخدم عداد مستعمرة لحساب المستعمرات في كل مجموعة من الألواح.

عبر عن النتائج كعدد وحدات تشكيل مستعمرة ، أو CFUs ، لكل جرام من الأنسجة. بعد تحضير وتلطيخ أجزاء من الأمعاء الدقيقة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مجهرا عالي الدقة لقياس الزغابات المعوية وسمك جدار الغشاء المخاطي الكلي. قم بتحليل أربع عينات على الأقل من كل فأر وقم بإجراء 20 قياسا على الأقل في كل عينة.

لإجراء فحص مجهري ضوئي عالي الدقة لعينات الدم ، استخدم منصة عزل الاهتزاز كقاعدة لنظام المجهر مع كاميرا فيديو وكمبيوتر لتسجيل الصور الحية. بعد معايرة صور الاختبار وفقا لبروتوكول النص ، ضع سبعة ميكرولترات من الدم المسحوب حديثا من كل فأر على شريحة زجاجية وأضف غطاء. ثم قم بتصوير وتسجيل عشرة إطارات صور بحجم 72 × 53.3 ميكرومتر مربع في كل عينة.

أخيرا ، باستخدام برنامج يوفر صورا بصرية عالية الدقة للعرض المباشر في الوقت الفعلي ، قم بقياس تركيز الحويصلات. كان متوسط درجة حرارة جسم قبل وبعد الإجهاد الحراري مباشرة 36.7 زائد أو ناقص 07 درجة مئوية و 40.3 زائد أو ناقص 0.17 درجة مئوية على التوالي. أدى تعرض الفئران للحرارة إلى تثبيط كبير لارتفاع الزغابات وسمك الغشاء المخاطي الكلي.

ومع ذلك ، فإن العلاج بسلالة BSB3 قبل الإجهاد ، يحمي الأمعاء من التأثير الضار للحرارة. لنقل البكتيريا من الأمعاء ، تم تحليل الغدد الليمفاوية المساريقية والكبد والطحال. كما هو موضح هنا ، تم عزل البكتيريا بتركيز 1.7 في عشرة إلى ثلاثة زائد أو ناقص 4.6 في عشرة إلى اثنين من CFUs لكل جرام من الأنسجة فقط في عينات من الغدد الليمفاوية المساريقية والكبد من الفئران المعالجة PBS المعرضة للحرارة.

من ناحية أخرى ، كانت جميع العينات المختبرة من التحكم والإجهاد الحراري التي تلقت سلالة BSB3 معقمة. لم يتم تسجيل أي تغيير في مستويات IL 1beta أو IL-6 أو TNFalpha أو إنترفيرون جاما سيتوكين في الفئران المجهدة للحرارة. ومع ذلك ، ارتفعت مستويات IL-10 و LPS في المعالجة بنظام تلفزيوني قبل المعالجة الحرارية.

لذلك ، منع العلاج المسبق B.subtilis BSB3 ارتفاع IL-10 و LPS في المصل بعد المعالجة الحرارية. أخيرا ، تم العثور على زيادة كبيرة في تركيز الحويصلات الحرة في دم الفئران التي تلقت PBS قبل الإجهاد الحراري ، ولكن ليس في BSB3 المعالجة. من المهم أن تتذكر استخدام مواد حرارية لجمع الدم والدقة للحفاظ على سوائل المصل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر مع التجميد والذوبان المتكرر ، واتباع إجراء معقم أثناء تحليل نقل البكتيريا.

يمكن إجراء هذا الإجراء مثل إعطاء البكتيريا بعد الإجهاد الحراري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول مضاعفات الإجهاد الحراري.