القائم HPLC الفحص لمراقبة خارج الخلية النكليوتيد / نوكليوزيد الأيض في خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام اللونوموغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي لتحديد استقلاب البيورين في ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن أو خلايا CLL المقاسة في ظروف مزرعة مختلفة. تم استخدام هذه الطريقة لتحديد متى وكيف يمكن للخلايا إنتاج الأدينوزين في البيئة خارج الخلية. وهذه مشكلة حرجة ، حيث أن الأدينوزين هو جزيء واقي للخلايا ومثبط للمناعة.

علاوة على ذلك ، فإنه يتطلب وسيطا ثقافيا ضخما والتحضير البسيط سهل للغاية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في دراسة استقلاب البيورين في البيئة الدقيقة للورم. وأدركنا أنه من الضروري أن يكون لديك طريقة سهلة وقابلة للتكرار لقياس هذا التمثيل الغذائي باستخدام الخلايا الأولية.

قم بعمل تخفيف واحد إلى ثلاثة من الدم الكامل بدرجة حرارة الغرفة واحد × محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS ، هذه الخطوة ضرورية للحصول على الخلايا الليمفاوية CLL المنقاة. ثم تستخدم لقياس التمثيل الغذائي للبيورين خارج الخلية. خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المنقاة من عينات الدم عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

أولا ، قم بوضع خمسة ملليلتر من وسائط الطرد المركزي الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. ونقل بعناية 10 مل من الدم المخفف. يتم الطرد المركزي على الفور عند 1 ، 500 مرة G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

استنشق جزءا من المادة الطافية بماصة مراعي زجاجية متصلة بمضخة تفريغ. ثم اجمع حلقة PBMC عند الواجهة ، بين وسائط الطرد المركزي الكثافة والبلازما المخففة بماصة خمسة ملليلتر. ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا.

اغسل الخلايا باستخدام PBS. جهاز طرد مركزي عند 500 ضعف G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق 10 ملايين PBMC في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للعزل.

وهو PPS ، بنقطة صفر واحد بالمائة BSA واثنين من مللي مولار EDTA مع درجة حموضة معدلة إلى سبعة نقاط أربعة. تحتاج الخلايا الليمفاوية CLL الآن إلى تنقية من مستحضرات PBMC. بعد ذلك ، أضف 10 ميكروغرامات من الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة للفأر المضادة ل CD3 و CD14 و CD16 ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد غسل الخلايا بمخزن العزل ، والطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق 10 ملايين PBMC في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للعزل. احتضان الخلايا المعاد تعليقها ب 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع إعادة تعليق لطيف. ثم ضع الأنبوب في حامل المغناطيس لمدة دقيقتين.

وانقل المادة الطافية مع الخلايا غير المرتبطة إلى أنبوب جديد بماصة سعة خمسة ملليلتر. بعد هذه الخطوة ، تكون الخلايا الليمفاوية CLL المنقاة جاهزة للاستخدام. لإعداد HPLC ، قم أولا بإعداد لترين لكل من المخزن المؤقت A والمخزن المؤقت B كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم قم بتوصيل عمود الحماية والعمود ب HPLC. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج HPLC ، وحدد الزر "استعراض المشروع". انتقل إلى قائمة الملف، وحدد طريقة جديدة، ثم طريقة الأداة.

قم ببرمجة طريقة عمود التوازن كما هو موضح في بروتوكول النص. اضبط معدل تدفق 1.00 مل في الدقيقة وقم ببرمجة كاشف الأشعة فوق البنفسجية للقراءة عند 250 نانومتر. احفظ الطريقة.

كرر هذا الإجراء لبرمجة أسلوب نموذج التشغيل المشار إليه في بروتوكول النص. اضبط معدل تدفق 1.00 مل في الدقيقة وقم ببرمجة كاشف الأشعة فوق البنفسجية للقراءة عند 260 نانومتر. احفظ الطريقة.

حدد الزر تشغيل العينات واختر طريقة مجموعة عينة جديدة من قائمة ملف. حدد الخيار الفارغ وأدخل رقم القارورة في جهاز أخذ العينات التلقائي واسم العينة وحجم الحقن البالغ 50 ميكرولترا. حدد مجموعة الأساليب، المحفوظة لعمود مجموعة الأساليب، وأدخل إجمالي وقت التشغيل بالدقائق.

أدخل أسلوب عمود التوازن في عمود مجموعة الأسلوب لكل تشغيل عينة. وأدخل إجمالي وقت التشغيل. تابع إنشاء منحنى معايرة قياسي لكل مركب، كما هو موضح في بروتوكول النص.

لاختبار استهلاك AMP ، وتوليد الأدينوزين والإينوزين ، أعد تعليق مليوني خلية CLL إيجابية CD19 CD5 في 250 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل. وقم بوضع الخلايا في صفيحة 48 بئر. أضف 250 ميكرولتر من 400 ميكرومولار AMP ، أو مثبطات AMP plus للحصول على تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومولار AMP.

قم بتضمين شرط في حالة عدم وجود الركيزة لاستخدامها كعينة فارغة. احتضن من 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية وقت الحضانة ، اجمع 500 ميكرولتر من المواد الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الباردة.

الطرد المركزي على الفور عند 17،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. انقل المواد الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مليلتر ، وإما المضي قدما في تحضير العينة لتشغيل HPLC أو تخزينها على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد المعالجة المسبقة بالمثبطات ، حضانة مع ركيزة AMP ، قم بتصفية المواد الطافية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة سعة 1.5 مليلتر مع مرشحات حقنة 0.2 ميكرون.

استخدم محاقن مليلتر واحدة للتصفية. إذا تم تزويد نظام HPLC بجهاز أخذ العينات التلقائي ، فقم بإعداد القوارير الزجاجية ل HPLC واستخدم الإدخالات الدقيقة سعة 100 ميكرولتر لكميات صغيرة من العينة. انقل ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من العينة في القارورة الزجاجية باستخدام ماصة دقيقة أو ماصة مراعي زجاجية.

احرص على النقل بدون فقاعات وإغلاق القارورة بغطاء المسمار. العينات جاهزة الآن للتحليل حسب المرحلة العكسية HPLC. حدد الزر تشغيل العينات واختر طريقة مجموعة عينة جديدة من قائمة ملف.

حدد الخيار الفارغ وحدد رقم القارورة في جهاز أخذ العينات التلقائي واسم العينة وحجم الحقن البالغ 50 ميكرولترا. حدد أسلوب عمود التوازن وأسلوب نموذج التشغيل الموضح في بروتوكول النص. لجميع عمليات التشغيل الفارغة والنموذجية التالية.

ثم حقن 50 ميكرولتر من فراغ الوسائط الخالية من المصل متبوعا بكل عينة. لتحديد تركيز البيورينات في كل عينة ، حدد كمية AMP والأدينوزين والإينوزين عن طريق الحصول على مناطق الذروة في أوقات الاحتفاظ الموضحة في بروتوكول النص. حدد الزر "معالجة" ، متبوعا بخيار "تكامل".

اختر نقطتي البداية والنهاية لكل قمة واحدة للحصول على قياس المساحة. يتم ذلك يدويا عن طريق تتبع خط بين نقطتي البداية والنهاية للذروة. تابع حساب AMP والأدينوزين والإينوزين الذي تستهلكها و أو تنتجها خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي المزمنة ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

يتم تقييم النسبة المئوية لخلايا سرطان الدم عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد اكتساب الخلايا الحية الملطخة بالأجسام المضادة المضادة ل CD19 و CD5. قبل العزلة السلبية للخلايا البائية ، تتوافق النسبة المئوية لخلايا CLL مع 75٪ بعد التنقية ، تصل النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية CLL B إلى 95٪ كما هو موضح هنا ، هي نتائج تمثيلية للأدينوزين والإينوزين الناتج عن الخلايا الليمفاوية الإيجابية CD73 بعد 30 دقيقة من الحضانة مع AMP كركيزة. العلاج المسبق بمثبط CD73 ، APCP ، يمنع تخليق الأدينوزين خارج الخلية تماما.

فيما يلي مخطط كروموتوغرام HPLC تم الحصول عليه من المواد الطافية لخلايا CLL الإيجابية CD73. معالج مسبقا أو لا معالج بمثبط الأدينوزين ديأميناز، هيدروكلوريد ENHA قبل 30 دقيقة من الحضانة باستخدام AMP. تشير النتائج إلى حصار تحويل الأدينوزين إلى إينوزين.

يتم تأكيد نفس النتائج من خلال المعالجة المسبقة لخلايا CLL باستخدام ديوكسي كوفورمايسين ، أو DCF ، وهو مثبط آخر للأدينوزين ديأميناز. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ويمكن تخزينها على الفور وتحليلها لاحقا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس مركبات البيورين الزائدة ووسائط زراعة الخلايا من خلايا سرطان الدم البشرية المنقاة. استخدام مثبطات الإنزيم بمثابة رقابة داخلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن إنشاء رموز معايرة قياسية جيدة لكل مركب يعد مشكلة حاسمة للحصول على تقدير كمي دقيق.

بديل أو مكمل لهذا ، يمكن للمحققين استخدام HPLC في المرحلة العكسية دون أقصى اكتشاف أو أسرع بطرق غير مباشرة مثل مقايسة أحادية النسيلة إلى الفوسفات الأخضر أو طريقة قاعدة cypherus. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطرق لإجراء أبحاث للتحقيق في استقلاب البيورين وعمل الإنزيم النشط في سياق الأورام الخبيثة أو الأورام الخبيثة الدموية وربط هذه الخصائص بالسمات السريرية أو الجزيئية للمرض. لا تنس أن العمل مع المواد المشتقة من المريض والمذيبات العضوية وحمض الهيدروكلوريك يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معطف المختبر والقفازات واستخدام غطاء المحرك الكيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء. الآثار المترتبة على هذه التقنية ذات صلة بالبيولوجيا الخلوية وربما العلاج. لأن المرضى الذين ينتجون الأدينوزين يتميزون عموما بتشخيص رديء.

تم تطبيق هذه الطريقة على الخلايا الليمفاوية CLL ، ولكن من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا الأولية ، فهي خط أو interdepense أو في حالة تعليق.