موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح عملية تنقية وقناة خماسية الوحدات (penameric) مرتبطة بربيطة وموجهة بصبغة مغزلية في مواقع محددة، ثم إعادة تشكيلها من أجل دراسات الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني. إن دراسة ديناميكيات بروتينات الغشاء في بيئة ذات صلة فسيولوجياً أمر بالغ الأهمية لفهم آلية عمل بروتين النقل الغشائي هذا بشكل كامل. وبناءً على هذه الاحتياجات، أعتقد أن تقنية الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني (EPR) والوسم المغزلي الموجه في مواقع محددة هي الوسيلة الأنسب.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها غير محدودة بحجم البروتين. وبناءً على ذلك، يعد الوسم المغزلي الموجه للموقع ومطيافية EPR التقنية الأمثل إذا كنت ترغب في دراسة ديناميكيات البروتينات الكبيرة أو البروتينات المعاد تشكيلها في الأغشية. قم بإدخال طفرات سيستين مفردة في جين GLIC عن طريق الطفرات الموجهة للموقع.

قم بإعداد مزرعة ليلية من طفرة السيستين لبروتين GLIC كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، أضف 100 milliliters من محلول بفر فوسفات البوتاسيوم المعقم إلى وسط مرق terrific المعقم بجهاز الأوتوكلاف. ثم أضف الجلوكوز المعقم، والكاناميسين، و10 milliliters من المزرعة الليلية.

يُحضن المزيج عند درجة حرارة 37 °C في هزاز بسرعة 250 rpm. يُضاف 50 mL من الجلسرول ويستمر رج المزرعة حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nm إلى 1.0 إلى 1.2. بعد تحفيز الخلايا باستخدام 200 µM من IPTG، يُعاد ضبط الهزاز على سرعة 250 rpm ويستمر التحضين لمدة 16 ساعة تقريبًا عند درجة حرارة 18 °C.

يتم حصاد الخلايا في زجاجات طرد مركزي سعة لتر واحد عن طريق الدوران عند 8500 ×g، في درجة حرارة 4 °C، لمدة 15 دقيقة. يتم سكب السائل الطافي ووزن الزجاجة التي تحتوي على كتل الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي. أعد تعليق كتلة البكتيريا في 150 mL من المنظم A المبرد بالثلج لكل لتر واحد من المزرعة.

قم بتجنيس الخلايا عن طريق تمريرها عبر جهاز تفتيت الخلايا في غرفة تبريد عند درجة حرارة 4 °C. كرر هذه العملية ثلاث مرات لضمان تحلل معظم البكتيريا. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 14,000 ×g لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. وبعد طرد السائل الطافي مركزياً عند 168,000 ×g لمدة ساعة واحدة، قم بسكب السائل الطافي بعناية دون تعكير راسب الغشاء. اسحب راسب الغشاء الناتج من لتر واحد من المزرعة وأعد تعليقه في Buffer A، مضافاً إليه 10% glycerol، ليصل الحجم النهائي إلى 50 milliliters.

أضف 0.5 grams من DDM إلى معلق الغشاء وقم بالتحريك الدوراني لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. بعد إذابة الغشاء، قم بإزالة الحطام الخلوي من المستخلص عن طريق الطرد المركزي بسرعة 168,000 ×g لمدة ساعة واحدة. في هذه الأثناء، قم بتحضير راتنج الأميلوز.

انقل ثلاثة مليلتر من الراتنج باستخدام ماصة إلى عمود كروماتوغرافيا فارغ من البولي بروبيلين. اغسل الراتنج بتمرير 10 أحجام من الحشوة من الماء ثلاث مرات، ثم 10 أحجام من الحشوة من Buffer A، الذي يحتوي على 0.5 millimolar DDM. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي برفق باستخدام ماصة وانقله إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مليلتر.

للقيام بعملية الربط على دفعات، أضف راتنج الأميلوز الموازن مسبقاً إلى الأنبوب المخروطي. قم بربط البروتين المستخلص براتنج الأميلوز عن طريق تحريك الخليط بحركة تمايلية لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، مرر المزيج بالكامل عبر عمود كروماتوغرافي واجمع السائل المتدفق.

خفف بروتين GLIC باستخدام 10 milliliters من Buffer A الذي يحتوي على 40 milliomolar من المالتوز بالإضافة إلى 0.5 millimolar من DDM و 05 millimolar من TCEP. يعمل TCEP على منع أكسدة السلاسل الجانبية للسيستئين. اجمع كامل ناتج الاستخلاص.

قم بتركيز البروتين المستخلص باستخدام جهاز تركيز مركزي ليصل التركيز إلى ما بين 4 و6 mg/mL. أضف بروتياز HRV 3C واحضن العينة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. لإجراء عملية الوسم المغزلي الموجه للموقع، أضف أولاً زيادة مولارية بمقدار عشرة أضعاف من الوسم المغزلي MTSL إلى العينة المهضومة بالبروتياز، وذلك لتحقيق نسبة مولارية بين مونومر GLIC وMTSL تبلغ 1:10.

بعد تحضين لمدة ساعة واحدة، أضف المزيد من وسم الدوران (spin label) بنسبة فائض مولاري تبلغ خمسة أضعاف، ثم حضّن لمدة ساعة أخرى. مرر العينة عبر عمود كروماتوغرافيا السوائل البروتينية السريعة باستبعاد الحجم، أو عمود FPLC، موازن مسبقاً بالمحلول المنظم A و 0.5 millimolar DDM لفصل وسم MBP المقطوع ووسم الدوران الحر الزائد عن خماسيات GLIC. ركز محلول البروتين باستخدام مركز طرد مركزي للوصول إلى تركيز نهائي يتراوح تقريباً بين ثمانية إلى عشرة milligrams per milliliter وضعه على الثلج.

تكون العينة الآن جاهزة لإعادة التكوين. ولتحضير الليبوزومات، اشطف دورقاً نظيفاً مستدير القاع سعة 25 milliliter بخمسة milliliters من الكلوروفورم، ثم جفف الدورق بتيار من غاز النيتروجين داخل خزانة استخراج الأدخنة. بعد ذلك، انقل 10 milligrams من الأسوليكتين إلى الدورق وجفف الدهون تحت تيار مستمر من غاز النيتروجين.

عندما يتبخر الكلوروفورم، ضع الدورق في جهاز تفريغ لمدة ساعة واحدة لضمان التجفيف التام. بعد ذلك، أضف 1 mL من Buffer A لإعادة التكوين إلى الليبيد المجفف، وقم برج الدورق بقوة باستخدام جهاز الـ vortex لتعليق كتلة الليبيد. ولتحضير حويصلات أحادية الطبقة صغيرة، قم بمعالجة معلق الليبيد باستخدام جهاز السونيكتور في حمام مائي بارد حتى يصبح محلول الحويصلات شبه شفاف ولا تُلاحظ أي تكتلات.

أضف إلى هذا الخليط DDM بتركيز نهائي قدره 4 mM واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ولإعادة تشكيل البروتين، أضف البروتين المنقى إلى خليط الدهون. بعد حضن العينة عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة مع التدوير اللطيف، خفف العينة إلى 15 mL باستخدام Buffer A. قم بإزالة المنظف المتبقي في المعلق باستخدام حبيبات البولي ستيرين ذات المسام الكارهة للماء التي تعمل على حبس المنظف.

أضف 80 milligrams من الخرز النظيف واترك معلق الليبوزوم في الحضانة طوال الليل على جهاز هزاز (nutator) عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، انقل الليبوزوم إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 25 milliliters باستخدام مرشح عمودي لإزالة الخرز، ثم خفف العينة أكثر لتصل إلى 25 milliliters. وبعد طرد العينات مركزياً عند 168,000 ×g لمدة ساعتين، اسكب الطافي وأعد تعليق الراسب باستخدام 100 µL من Buffer B. ولإجراء مطيافية الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني (EPR) بالموجة المستمرة، انقل أولاً معلق الليبوزوم إلى أنبوب سعة 200 µL وقم بترسيب العينات باستخدام جهاز الطرد المركزي.

بعد التخلص من الطافي، تصبح العينة جاهزة لقياسات EPR. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المنظم من عينة الليبوزوم. ولإجراء عملية تبديل المحلول المنظم، انقل 20 microliters من راسب الليبوزوم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة.

أضف 180 µL من المنظم D (Buffer D) واتركه في الحاضنة عند درجة حرارة 42 °C لمدة خمس دقائق. قم بطرد العينة مركزياً، وأزل الطافي باستخدام الماصة، وكرر هذه العملية ثلاث مرات لضمان التبادل الكامل للمنظم. وتعد الشعيرات البلاستيكية النفاذة للغازات مناسبة لقياسات كل من أشكال الخطوط الطيفية وإمكانية وصول المذيب.

انقر بالشعيرة الدموية على راسب البروتيلبوزوم لسحب العينة إلى الداخل، ثم أغلق الطرف باستخدام شمع العظم. يظهر هنا التوصيف البيوكيميائي لطفرات GLIC الموصومة بالغزل من خلال كروماتوغرام الترشيح الهلامي لـ GLIC الموصوم بالغزل بعد الانقسام البروتيني لعلامة MBP. تتوافق القمم مع خماسي GLIC و MBP الحر.

يُظهر هلام SDS page البروتين الاندماجي GLIC-MBP أحادي القسيمة غير المقطوع قبل الترشيح الهلامي، بالإضافة إلى أجزاء MBP وGLIC المستخلصة من الترشيح الهلامي. تم إجراء مقايسة تعتمد على FRET لمراقبة حالة التجميع لبروتين GLIC المعاد تشكيله في ليبيدات غشائية متنوعة. أُجريت قياسات FRET للعينات بعد إعادة التشكيل طوال الليل وبعد دورات متعددة من تجميد وإذابة العينات.

في رقعة داخلية-خارجية مستأصلة من حويصلات asolectin المعاد تشكيلها، يتم تنشيط GLIC عن طريق قفزات في pH باستخدام مبدل محاليل سريع. ويُلاحظ تنشيط القنوات في غضون 10 milliseconds تقريبًا، ثم تفقد حساسيتها بثابت زمني يتراوح من ثانية إلى ثلاث ثوانٍ. كما لوحظت إعادة ترتيبات هيكلية أثناء تنشيط القنوات.

هنا، تُظهر أطياف الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني بالموجة المستمرة لموقع في لولب M2 المبطن للمسام تغيرات في السعة والأشكال استجابةً لتغيرات الـ pH. وتعد مطيافية EPR نهجاً بنيوياً لا مثيل له لقياس التغيرات التشكلية لبروتينات الغشاء في بيئتها الأصلية، كما أنها توفر لمحة عن التفاصيل الجزيئية لديناميكيات البروتين التي تكون محجوبة في بنيات الأشعة السينية عالية الدقة أو بنيات المجهر الإلكتروني المبرد cryo-EM. وعند العمل بهذه التقنية، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الطفرات غالباً ما تؤدي إلى استقرار أوليغومري منخفض وضعيف للبروتين.

لذلك، قد تحتاج إلى ابتكار استراتيجية لمواجهة هذه المشكلات. إن دمج هذه النتائج المستخلصة من دراسات EPR مع القياسات الوظيفية يمكن أن يمنحنا صورة أكثر اكتمالاً لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة، وتهدف التطورات التكنولوجية المستقبلية إلى استخدام هذا النهج القوي لدراسة قنوات بشرية أكثر تعقيداً في ظروف دهنية أكثر تطوراً.