جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توليد خلايا متغصنة ومتساهلة الناضجة من الخلايا الوحيدة للتجريب أو تطوير اللقاح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة من خلال توفير نموذج لدراسة تطور الخلايا المتغصنة ونضجها وعرضها للمستضد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح توليد أعداد كبيرة من الخلايا المتغصنة في المختبر للتجريب.

ابدأ تخصيب الخلايا الوحيدة عن طريق خلط 20 ميكرولترا من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المعدة مسبقا ، أو تعليق خلية PBMC مع 20 ميكرولترا من تريبان الأزرق ، لحساب عدد الخلايا الحية باستخدام مقياس الخلوي. ثم ، الطرد المركزي تعليق الخلية. استنشق المادة الطافية تماما ، وأعد تعليق حبيبات الخلية إلى تركيز 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين لمدة 10 إلى الخلايا السابعة.

أضف 20 ميكرولترا من حبات CD-4 الدقيقة لكل 10 إلى الخلايا السابعة. تخلط جيدا وتحتضن الخلايا لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ لكل 10 خلايا سابعة ، وقم بالطرد المركزي للخلايا.

استنشق المادة الطافية تماما ، وأعد تعليق حبيبات الخلية. احصل على عمود متوسط بحد أقصى مرتين في 10 إلى الثامن إجمالي الخلايا ، وضع العمود في المجال المغناطيسي للفاصل. بعد ذلك ، اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.

قم بتعليق الخلية على العمود ، واجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود في أنبوب سعة 15 ملليلترا. استبدل أنبوبا جديدا سعة 15 ملليلتر أسفل العمود واغسل العمود ثلاث مرات بسعة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. تأكد من أن خزان العمود فارغ قبل إضافة مخزن تلطيخ جديد بين الغسلات.

قم بإزالة العمود من الفاصل ، وضعه على أنبوب جديد سعة 15 مل. ماصة مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ على العمود ، وقم على الفور بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. بعد ذلك ، كرر خطوات الفصل المغناطيسي باستخدام الكسر المصور في عمود جديد لزيادة نقاء خلايا CD14 plus.

قم بزرع أربع مجموعات من CD14 بالإضافة إلى الخلايا الوحيدة بتركيز صفر نقطة ثلاث إلى نقطة صفر خمس مرات 10 إلى السادس لكل مليلتر من وسط زراعة الخلايا IL-4 في ستة ألواح آبار. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الرابع ، قم بإزالة 850 ميكرولتر من الوسط من المزرعة وأجهزة الطرد المركزي.

شفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا. أضف خليط الخلية مرة أخرى إلى المزرعة. في اليوم الخامس ، أضف ميكرولتر واحد من مخزون فيتامين D3 وميكرولتر واحد من مخزون ديكساميثازون لكل لتر واحد من المجموعات المتوسطة إلى مجموعتين ، لتوليد moDCs للتحمل.

في اليوم السادس ، أضف 200 نانوجرام لكل مليلتر من GMCSF و 200 نانوجرام لكل مليلتر من IL-4 إلى جميع المجموعات. أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من LPS إلى إحدى المجموعات المعالجة ب GMCSF و IL-4 فقط لتوليد moDCs ناضجة. أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من LPS إلى مجموعة واحدة من moDCs ذات التحمل لتوليد موتيكاسي التحمل LPS.

أخيرا ، في اليوم السابع ، قم بحصاد أنواع مختلفة من moDCs عن طريق شطف طبق الاستزراع باستخدام PVS EDTA. تم إنشاء moDCs غير الناضجة عن طريق إضافة GMCSF و IL-4 إلى CD-14 المنقى بالإضافة إلى الخلايا الوحيدة في الأيام صفر والرابع والسادسة. أدت إضافة فيتامين D3 و dixethazone بعد GMCF و IL-4 إلى تمايز moDCs غير الناضجة إلى moDCs متحملة.

تمت إضافة LPS للحث على نضوج moDCs غير الناضجة إلى moDCs الناضجة. وتم تحفيز moDCs التحمل باستخدام LPS للتحقق من مقاومة النضج. كشف تحليل لعلامات سطح التيار المستمر أن moDCs الناضجة تعبر عن أعلى مستويات علامات النضج HLA-DR و CD80 و CD83 و CD86.

على العكس من ذلك ، أظهرت moDCs ذات التحمل زيادة في التعبير عن CD14 و BDCA3 والنصوص الشبيهة بالغلوبولين المناعي مقارنة ب moDCs غير الناضجة والناضجة. باستخدام CMXRos الأحمر لتعكس النشاط الفطري ، لوحظ أن moDCs ذات التحمل لها نشاط فطري أعلى مقارنة بالأنواع الفرعية الأخرى التي تفرق بين moDC. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف ميزات التمثيل الغذائي في الخلايا المتغصنة لتطوير اللقاحات والعلاج المناعي.