وPhenotyping حمية لالفئران المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة الجينات المتورطة في الأمراض البشرية الشيخوخة

الهدف العام من نظام الاختبار هذا هو إنشاء سلسلة من الاختبارات البسيطة التي يمكن استخدامها كخط أنابيب أولي للتنميط الظاهري لتوجيه التحقيقات التفصيلية اللاحقة في الأنماط الظاهرية السلوكية وبنية ووظيفة الأنسجة. ما إذا كانت الأنماط الظاهرية السلوكية والخلوية للأمراض البشرية قد تم تلخيصها في نموذج الفأر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء الاختبارات في مختبرات ليس لديها خبرة سابقة في مثل هذه التجارب دون استثمار كبير مع استمرار إبلاغ المزيد من الدراسات التفصيلية.

قم بإجراء اختبار الطرف الخلفي يوميا من اليوم الرابع إلى العاشر بعد الولادة لتقييم قوة عضلات الطرف الخلفي القريب وضعفه وإرهاقه. للبدء ، دع الفئران تتأقلم مع منطقة الاختبار لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد أنبوب مخروطي جديد سعة 500 مل عن طريق غسله بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم دفع كرة قطنية أو اثنتين في قاع الأنبوب.

قم بتأمين هذا الأنبوب في وضع رأسي للاختبار. عندما لا يتم اختبارها ، احتفظ بالجراء مع السد للحفاظ على درجة حرارتها. بعد التأقلم لمدة نصف ساعة ، قم بإزالة الجرو من القفص وتسجيل وزنه.

ثم قم بتعليق حديث الولادة برفق من أطرافه الخلفية فوق حافة الأنبوب ، بحيث يواجه الجرو القطن. ثم احسب عدد محاولات السحب التي قام بها الجرو وقم بقياس زمن الوصول إلى السقوط. بعد الانتظار 30 ثانية ، كرر الاختبار.

بعد الاختبار الثاني ، قم بتسمية الجرو بعلامة. ثم افركي الجرو برفق بالفراش من قفص المنزل وأعده إلى السد. نظرا لأنه لا يمكن تمييز صغار P8 الأكبر سنا ، والتعرف عليهم بقص إصبع القدم.

قبل المتابعة إلى الجرو التالي ، امسح أنبوب الاختبار بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإجراء اختبار مراقبة الفطام يوميا من P19 إلى P21 لتسجيل مستويات الحركة والنشاط العام. ابدأ بترك الفئران تتأقلم مع منطقة الاختبار لمدة 30 دقيقة.

بينما تتأقلم الجراء ، قم بإعداد الساحة. ضع علامة على صندوق اختبار زجاج شبكي بشبكة ستة × ستة مربعات بوصتين. قبل استخدام العلبة ، نظفها بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم ضع كاميرا فيديو بحيث يملأ المنظر الجانبي للصندوق بأكمله مجال الرؤية. توحيد مظهر المناطق المحيطة لتجنب إدخال الحداثة. قبل الاختبار ، انقل الفطام إلى كوب تثبيت نظيف وسجل وزنه.

ثم بدأ تسجيل الفيديو. أولا ، قم بتصوير بطاقة تعريف الاختبار برقم تعريف الماوس وعمره والتاريخ الحالي. ثم انقل الماوس من كوب الإمساك إلى المربع المركزي.

لمدة ثلاث دقائق ، احسب عدد الخطوط التي عبرها كلا الكفوف الأمامية. بعد ثلاث دقائق ، أعد الماوس إلى قفص نظيف وقم بإنهاء تسجيل الفيديو. بين كل اختبار ، قم بتنظيف الصندوق بنسبة 70٪ من الإيثانول.

من مقاطع الفيديو ، احسب أحداث التربية ، وهو عندما يقف الفأر مع كلا الكفوف الأمامية بعيدا عن الدعم. احسب أيضا أحداث الحلاقة ، والتي تحدث عندما يشارك كلا الكفوف الأمامية في التنظيف. قم بإجراء اختبار قوة القبضة في أيام متناوبة بين P22 و P26 لتقييم القوة العصبية العضلية.

كالعادة ، امنح الفئران 30 دقيقة للتكيف مع منطقة الاختبار. جهاز الاختبار عبارة عن صندوق زجاجي شبكي بشبكة شبكية. نظف كلاهما بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم قم بتبطين الجزء السفلي من الصندوق بطبقة من غلاف الفقاعات للحشوة وقم بتغطية غلاف الفقاعات بالورق لامتصاص الإفرازات. تابع فصل فئران الاختبار وتحميلها في أكواب فردية. الآن ، ضع الماوس الأول على مركز الشبكة السلكية واقلب الشبكة ببطء إلى 10 إلى 20 سم فوق السطح الناعم للصندوق.

قم بقياس زمن الوصول إلى السقوط أو إنهاء الاختبار بعد 60 ثانية ، إذا لم يسقط الماوس. ثم أعد الماوس الأول إلى كوب الإمساك. بين الاختبارات ، امسح الشبكة بنسبة 70٪ من الإيثانول واستبدل الورق فوق غلاف الفقاعات.

ثم قم بإجراء الاختبار على الفئران الآخرين في المجموعة. بعد اختبار كل فأرة مرة واحدة ، كرر العملية مرتين أخريين لثلاث تجارب لكل ماوس. إذا كان هناك أقل من ثلاثة فئران في المجموعة ، فتأكد من وجود وقت تعافي بين التجارب لا يقل عن خمس دقائق.

للحصول على NADH Diaphorase Stain ، اجمع بين كميات متساوية من محلول NADH الطازج ومحلول NBT الطازج. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول التلوين إلى كل شريحة واحتضان الشرائح في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. للحصول على صبغة هيدروجين سكسينات ، قم بإعداد محلول من 0.1 مولار سكسينات الصوديوم و 1.25 مولار NBT و 0.2 محلول فوسفات مولار.

ثم أضف ملليلتر واحد لكل شريحة. قم بتعبئة الشرائح في غرفة رطبة واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد الحضانة بأي من البقعة ، استنشق محلول التلوين واغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر.

ثم اغسل الشرائح من خلال سلسلة من حمامات الأسيتون التي تزيد وتنخفض في التركيز. مع كل تركيز من الأسيتون ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة دقيقتين لكل غسلة. أخيرا ، اشطف الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر.

ثم قم بتركيب الشرائح بوسط مائي. تم فحص الفئران التي لا تحتوي على تعبير HTRA2 باستخدام بطارية الاختبارات الموصوفة ومقارنتها بعناصر التحكم في رفيقة القمامة. لم يلاحظ أي تغيير في عدد عمليات السحب أو زمن الوصول إلى الانخفاض بين P4 و P6. بين P7 و P10 ، لوحظ انخفاض في القوة العصبية العضلية.

في اختبار النشاط ، كان هناك انخفاض في نشاط الفئران بالضربة القاضية HTRA2. أظهرت الفئران بالضربة القاضية HTRA2 أيضا انخفاضا في القوة في اختبار قبضة الشبكة السلكية. يظهر تلطيخ H و E أن الفئران بالضربة القاضية HTRA2 لم يكن لديها تغييرات واضحة في بنية الشبكية مقارنة بالضوابط في P35.

أخيرا ، تم استخدام التلوين الكيميائي النسيجي للنشاط المعقد لسلسلة نقل الإلكترون لتحديد التغيرات في وظائف إنزيم الجهاز التنفسي. كان هناك انخفاض في تلطيخ الفئران بالضربة القاضية HTRA2 مقارنة بالضوابط. لوحظ ذلك في المخيخ والمخطط ، ولكن ليس القشرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم النشاط والقوة العصبية العضلية للفئران المعدلة وراثيا ، وكذلك كيفية الجمع بين هذه الدراسات والمحاور الخلوية. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.