التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

الهدف العام من هذا الإجراء ، هو إنشاء نظام مناسب لتحليل الحمض النووي لمجهر epifluorescent ، لمعالجة الحمض النووي لجزيء واحد على الأسطح الزجاجية المعدلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تصور الحمض النووي. عند فحص الحمض النووي الذاتي ، وكذلك البروتينات المرتبطة بالحمض النووي والجزيئات الصغيرة الأخرى.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على مراقبة وتحليل الحمض النووي المتحرك بسهولة. للبدء ، ضع أغطية زجاجية على رف PTFE وثبتها في مكانها ، باستخدام قطعة من شريط ختم الخيط PTFE. بعد لف الغطاء ، اترك قطعة من الشريط بطول خمسة سنتيمترات لاستخدامها في التعامل مع الرف أثناء إجراء التنظيف.

في غطاء الدخان ، امزج 350 ملليلتر من حمض الكبريتيك و 150 مل من بيروكسيد الهيدروجين في دورق زجاجي سعة لتر واحد لعمل محلول نقش سمكة الضاري المفترسة. ثم ضع رف الأغطية في المحلول. بعد ساعتين ، أفرغ الدورق واشطف الغطاء جيدا بالماء منزوع الأيونات.

استمر في شطف الغطاء حتى يصل درجة الحموضة في الماء في الدورق إلى درجة حموضة محايدة. بعد ذلك ، قم بصوتنة رفوف الأغطية في دورق ماء مائي لمدة 30 دقيقة ، لتنظيف واشتقاق الركائز الزجاجية. الماء الفارغ من الدورق ، قبل الأمينوسيلان مباشرة. للبدء ، قم بإعداد محلول الأمينوسيلان ، عن طريق إضافة ملليلترين من الألكوكسيسيلان ، و 10 ملليلتر من حمض الخليك الجليدي إلى 200 مل من كحول الميثيل في حاوية نظيفة من البولي بروبيلين.

متبوعا بوضع الأغطية النظيفة في المحلول. بعد ذلك ، ضع الطبقات التي تم تنظيفها في المحلول المحضر ورجها في درجة حرارة الغرفة و 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بصوتنة الحاوية مع الغطاء المشتق لمدة 15 دقيقة عند 75 واط.

ثم رجها مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة و 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بمجرد الانتهاء ، أفرغ المحلول من الدورق واشطف الغطاء ثلاث مرات بعناية. مرة واحدة مع كحول الميثيل ومرتين مع الكحول الإيثيلي.

بعد الشطف النهائي ، قم بتخزين الغطاء في الكحول الإيثيلي واستخدمه في غضون أسبوعين. أولا ، اصنع 10 مل من محلول بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار وقم بتصفيته من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون. بعد ذلك ، قم بإذابة ملليغرامين من كربونات البيوتين PEG succinimidyl و 80 ملليغرام من PEG succinimidyl valerate في 350 ميكرو لترا من محلول بيكربونات الصوديوم المصفى.

حماية المحلول من الضوء باستخدام أنبوب حماية من الضوء. قم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي فقاعات. بعد ذلك ، اشطف شريحة زجاجية بالأسيتون متبوعا بالكحول الإيثيلي.

بمجرد شطفها ، اترك الشريحة تجف تماما في الهواء. ضع قطرة 50 ميكرولتر من محلول PEG على الشريحة الزجاجية النظيفة. قم بخفض غطاء أحمري أحمري ببطء على القطرة بزاوية طفيفة ، حتى لا تولد أي فقاعات هواء تحت الغطاء.

بعد ذلك ، ضع الشرائح في غرفة مستوية ومظلمة ومرطبة لمدة ثلاث ساعات على الأقل إلى ليلة وضحاها ، في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء ، أغلق محلول PEG المتبقي في أنبوب الحماية من الضوء ، واحتفظ به عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اشطف أغطية PEGylated جيدا بالماء منزوع الأيونات ثم قم بتخزينها في مكان مظلم وجاف حتى يتم استخدامها.

من أجل إنشاء غرفة التدفق ، ضع شرائط شريط لاصقة على الوجهين على حامل أكريليك ، بحيث يتم محاذاته بشكل عمودي على فتحات المدخل والمخرج ولا تزعج أيا من فتحات القناة. ثم افركي الشريط باستخدام طرف الماصة لإغلاق القنوات. بعد ذلك ، ضع غطاء PEGylated ، بحيث يكون الجانب PEGylated متجها لأسفل ، في الجزء العلوي من الشريط لعمل غرف التدفق.

لمنع تسرب أي محلول ، اضغط على الجزء العلوي من غطاء فوق المنطقة التي يتم فيها وضع الشريط على الوجهين. ثم أضف غراء إيبوكسي سريع الجفاف إلى حواف الغرف لتثبيته في مكانه. بعد ذلك ، قم بتوصيل قطعة من الأنابيب بطول 2.5 سم بحقنة محكمة للغاز وأغلق المفصل بغراء الايبوكسي.

بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب طويل ومرن بالأنبوب القادم من المحقنة. ومرة أخرى ، ختم المفصل بغراء الايبوكسي. املأ الأنبوب المرتبط بالمحقنة بالماء منزوع الأيونات ، وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء.

بعد ذلك ، أدخل الأنبوب في فتحة غرفة التدفق المختومة بغراء الايبوكسي. وضع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر على الفتحة الأخرى ، لاستخدامها كخزان. اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة على 50 ميكرولتر في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتدفق 20 ميكرولترا من محلول بروتين أفيدين إلى الغرفة واحتفظ بها لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من نيوكليوتيدات أوليغو ديوكسي البيوتينيل في حقنة. قم بتدفقها إلى الغرفة واحتفظ بها لمدة 10 دقائق.

إذا تم استخدام ترانسفيراز طرفي ، فتخط تحميل نيوكليوتيدات oligo deoxy. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من محلول الحمض النووي في حقنة ، وقم بتدفقها إلى الغرفة بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة واحتفظ بها لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، اغسل غرفة التدفق ب 40 ميكرولتر من 1X TE buffer بسرعة 50 ميكرولتر في الدقيقة.

بمجرد غسلها ، قم بتحميل الغرفة ب 40 ميكرولترا من نفس FP-DBP بتركيز 80 نانو مولار ، في 1X TE.To رؤية نطاق التمدد الكامل لجزيئات الحمض النووي ، قم بتطبيق معدلات تدفق مختلفة وفقا لأطوال الحمض النووي المستخدمة. راقب الحمض النووي تحت عدسة موضوعية 60X ، باستخدام مجهر الفلورسنت. فيما يلي مقطع فيديو مجهر فلوري يظهر جزيئات الحمض النووي لامدا للعاثية ، المربوطة بالسطح ، والتي يتم شدها عن طريق التدفق بعد الربط باستخدام نيوكليوتيدات أوليغو تكميلية بيوتينيل.

تحت التدفق ، يبلغ طول جزيئات الحمض النووي الممدودة بالكامل 16.5 ميكرون. في المقابل ، فإن العاثية T4 الحمض النووي molemcules ، ممدودة بطول 56.4 ميكرون ، تحت التدفق. هذا الاستطالة قابل للعكس ، ويمكن تمديد الحمض النووي واسترخاءه عدة مرات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام FP-DBP في تحليل الحمض النووي الأكبر بالإضافة إلى إظهار تمدد واسترخاء بوليمر الحمض النووي.