التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام ملائم لتحليل الحمض النووي (DNA) باستخدام مجهر إبيفلوروسنت (epifluorescent microscope)، وذلك للتحكم في جزيئات الحمض النووي المنفردة على أسطح زجاجية معدلة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تصوير الحمض النووي، سواء عند فحص الحمض النووي نفسه، أو البروتينات المرتبطة بالحمض النووي والجزيئات الصغيرة الأخرى.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في القدرة على مراقبة وتحليل الحمض النووي (DNA) المتحرك بسهولة. للبدء، ضع شرائح غطاء زجاجية على رف من مادة PTFE وثبتها في مكانها باستخدام قطعة من شريط ختم تسرب PTFE. بعد لف شرائح الغطاء، اترك قطعة من الشريط بطول خمسة سنتيمتر لاستخدامها في مناولة الرف أثناء إجراء عملية التنظيف.

في خزانة استخلاص الغازات، اخلط 350 millileters من حمض الكبريتيك و 150 milliliters من بيروكسيد الهيدروجين في دورق زجاجي سعة لتر واحد لتحضير محلول نقش البيرانا. بعد ذلك، ضع حامل شرائح الغطاء في المحلول. وبعد مرور ساعتين، أفرغ الدورق واغسل شرائح الغطاء جيداً بالماء منزوع الأيونات.

استمر في شطف شرائح التغطية حتى تصل درجة الحموضة (PH) للمياه في الكأس إلى المستوى المتعادل. بعد ذلك، قم بمعالجة رفوف شرائح التغطية باستخدام الموجات فوق الصوتية (sonicate) في كأس يحتوي على الماء لمدة 30 دقيقة، لتنظيف الركائز الزجاجية وإزالة الشوائب. أفرغ الماء من الكأس مباشرة قبل البدء بعملية الأمينوسيلنة (aminosilanization). للبدء، قم بتحضير محلول الأمينوسيلنة عن طريق إضافة 2 mL من الألكوكسيسيلان و 10 mL من حمض الخليك الثلجي إلى 200 mL من ميثيل الكحول في حاوية نظيفة من مادة البولي بروبيلين.

يتبع ذلك وضع الشرائح الغطائية النظيفة في المحلول. ثم، ضع الشرائح الغطائية التي تم تنظيفها في المحلول المُحضّر ورُجّها في درجة حرارة الغرفة وبسرعة 100 rpm لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بعملية سونيكة (sonication) للحاوية التي تحتوي على الشرائح الغطائية المشتقة لمدة 15 دقيقة بقدرة 75 watts.

بعد ذلك، قم برجّها مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة وبسرعة 100 rpm لمدة 30 دقيقة على الأقل. وبمجرد الانتهاء، أفرغ المحلول من الكأس واغسل أغطية الشرائح ثلاث مرات بعناية؛ مرة واحدة باستخدام الميثيل الكحول ومرتين باستخدام الإيثيل الكحول.

بعد عملية الشطف النهائية، تُحفظ شرائح التغطية في الكحول الإيثيلي ويتم استخدامها في غضون أسبوعين. أولاً، يتم تحضير 10 milliliters من محلول بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.1 molars ويُرشح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.22 micron. بعد ذلك، تُذاب 2 milligrams من biotin PEG succinimidyl carbonate و 80 milligrams من PEG succinimidyl valerate في 350 micro liters من محلول بيكربونات الصوديوم المُرشح.

قم بحماية المحلول من الضوء باستخدام أنبوب واقٍ من الضوء. قم برج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز المرج (Vortex) لمدة 10 ثوانٍ، ثم قم بطرده مركزياً عند 10,000 x g لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي فقاعات. بعد ذلك، اشطف شريحة زجاجية باستخدام الأسيتون متبوعاً بالإيثيل كحول.

بمجرد الشطف، اترك الشريحة لتجف تماماً في الهواء. ضع قطرة بحجم 50 µL من محلول PEG على الشريحة الزجاجية النظيفة. أنزل غطاء الشريحة المعالج بالأمينو سيلان ببطء فوق القطرة بزاوية طفيفة، وذلك لتجنب تكوين أي فقاعات هوائية تحت غطاء الشريحة.

بعد ذلك، ضع الشرائح في غرفة مستوية ومظلمة ورطبة لمدة تتراوح من ثلاث ساعات على الأقل إلى ليلة كاملة، في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء، قم بغلق محلول PEG المتبقي في أنبوب الحماية من الضوء، واحفظه في درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد فترة الحضن، اشطف الأغطية الزجاجية التي تمت معالجتها بـ PEG جيداً بالماء منزوع الأيونات، ثم خزنها في مكان مظلم وجاف حتى يحين وقت استخدامها.

من أجل إنشاء غرفة التدفق، ضع شرائط من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على حامل أكريليك، بحيث تكون محاذية بشكل عمودي لفتحات المدخل والمخرج ولا تعيق أيًا من فتحات القنوات. بعد ذلك، قم بفرك الشريط باستخدام رأس ماصة لإحكام سد القنوات. ثم ضع شريحة غطاء مُعالج بالـ PEG، بحيث يكون الجانب المُعالج بالـ PEG متجهًا للأسفل، فوق الشريط لتكوين غرف التدفق.

لمنع تسرب أي محلول، اضغط على الجزء العلوي من غطاء الشريحة فوق المنطقة التي وُضع فيها الشريط اللاصق ذو الوجهين. بعد ذلك، أضف غراء إيبوكسي سريع الجفاف إلى حواف الحجرات لتثبيتها في مكانها. ثم قم بتوصيل قطعة أنبوب بطول 2.5 centimeter بسرنجة محكمة الغلق بالغاز وأحكم سد الوصلة باستخدام غراء الإيبوكسي.

بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب طويل ومرن بالأنبوب الخارج من المحقنة. ومرة أخرى، أحكم إغلاق الوصلة باستخدام غراء الإيبوكسي. املأ الأنبوب المتصل بالمحقنة بالماء منزوع الأيونات، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية.

بعد ذلك، أدخل الأنبوب في فتحة غرفة التدفق المسدودة بغراء الإيبوكسي. وضع رأس ماصة سعة 200 microliter على الفتحة الأخرى، ليُستخدم كخزان. اضبط معدل التدفق في مضخة الحقنة على 50 microliters في الدقيقة.

بعد ذلك، يتم تمرير 20 µL من محلول بروتين الأفيدين في الحجرة والاحتفاظ به لمدة 10 دقائق. تالياً، يتم تحميل 20 µL من قليلات النيوكليوتيد (oligo deoxy nucleotides) المبيوتنة في سرنجة، ثم تمريرها في الحجرة والاحتفاظ بها لمدة 10 دقائق.

في حال استخدام إنزيم ترانسفيراز النهاية (terminal transferase)، يتم تخطي خطوة تحميل قليلة النوكليوتيدات منزوعة الأكسجين (oligo deoxy nucleotides). بعد ذلك، يتم تحميل 20 µL من محلول DNA في حقنة، ثم تدفقه إلى الغرفة بمعدل 10 µL/min والحفاظ عليه هناك لمدة 30 دقيقة. وعقب فترة الحضانة التي استمرت 30 دقيقة، تُغسل غرفة التدفق بـ 40 µL من محلول TE buffer بتركيز 1X بمعدل 50 µL/min.

بمجرد الغسل، قم بتعبئة الحجرة بـ 40 microliters من نفس الـ FP-DBP بتركيز 80 nano-molar، في 1X TE. ولرؤية النطاق الكامل لتمدد جزيئات الـ DNA، قم بتطبيق معدلات تدفق مختلفة وفقاً لأطوال الـ DNA المستخدمة. افحص الـ DNA تحت عدسة شيئية بقوة 60X، باستخدام مجهر فلوري. يوضح فيديو المجهر الفلوري هنا جزيئات DNA الخاصة بالعاقفة lambda، المربوطة بالسطح، وهي تتمدد بفعل التدفق بعد الربط مع قليلات نوكليوتيد مكملة مبيوتينية.

تحت تأثير التدفق، يبلغ طول جزيئات DNA الممتدة بالكامل 16.5 microns. وفي المقابل، تمتد جزيئات DNA الخاصة بـ bacteriophage T4 إلى طول 56.4 microns تحت التدفق. هذا الامتداد عكسي، ويمكن تمديد الـ DNA وإرخاؤه عدة مرات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام FP-DBP في تحليل الحمض النووي DNA الأكبر حجماً، بالإضافة إلى إثبات تمدد واسترخاء بوليمر DNA.