الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الاستجابات الكهربائية داخل الخلايا لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الداخلية البصرية لمحفزات الضوء الخاضعة للرقابة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الترميز العصبي ، مثل كيفية قيام محفزات الضوء بتشفيرها في إحدى استجاباته ، أو كيف تستخرج معلوماتها المرئية والمستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الداخلية من محفزات الضوء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تسجيلات طويلة الأمد وعالية الجودة من الدراسة مع ضرر طفيف لبيئة داخل الخلايا وأخذ عينات المعلومات.

ميزة العرض التوضيحي التي قد يؤثر عليها هذا أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطواتها المختلفة لأدائها بشكل صحيح دون رؤيتها. اسحب قطبا كهربائيا دقيقا مرجعيا من البورسليكات الخيطية أو من أنابيب زجاج الكوارتز باستخدام مجتذب ماصة قياسي. حاول تحقيق تفتق قصير وتدريجي.

تختلف الإعدادات الدقيقة بين الأدوات. حجم المسام عند الحافة ليس حاسما لأنه سيتم كسره للتجارب. ثم اسحب قطب تسجيل من نفس الأنبوب الزجاجي وحاول تحقيق تفتق تدريجي دقيق بطول 10 إلى 15 ملم.

في المجهر الضوئي ، قم بتركيب القطب الكهربائي على جانب زجاجي بمادة لاصقة متعددة واستخدم هدفا هواءيا 40x لفحص طرفه. يتناقص القطب الكهربائي الجيد بسلاسة إلى طرف صغير غير مرئي ، يمكن من حوله رؤية أنماط تداخل متوازية مستمرة أغمق وأخف وزنا. قبل التجربة مباشرة ، قم بإعادة ملء القطب المرجعي بجرس ذبابة ، باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر متصلة بمرشح جسيمات ، بطرف بلاستيكي ناعم.

بالنسبة لتجارب المستقبلات الضوئية ، قم بتحميل قطب التسجيل بكلوريد البوتاسيوم 3 مولار حتى تتشكل قطرة في نهايته الكبيرة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الضوضاء من تقاطع السائل أثناء التسجيل. للعمل مع الخلايا المتطرفة متضخمة الهيستامينرجيك ، املأ أقطاب التسجيل ب 3 أسيتات بوتاسيوم مولار ، 0.5 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم لتقليل التأثير على بطارية كلوريد الخلية.

ابدأ بتحميل قارورة ذبابة جديدة بذباب عمره خمسة إلى 10 أيام. الذباب الأصغر سنا أكثر هشاشة ، ولكن يمكن تسجيله من. حدد الذبابة الأولى للفيزيولوجيا الكهربية.

الأسهل التعامل مع الإناث الكبيرات. عندما تكون في أنبوب الاصطياد، استفد من ميلها المتأصل إلى الصعود لأعلى في طرف الماصة وتغطية الطرف الأصغر. بعد ذلك، قم بتوصيل حقنة سعة 100 مل بخرطوم بلاستيكي مرن بطرف الماصة، والتي يتم تكبيرها فقط للسماح لذبابة الفاكهة بالمرور وتوصيل الطرف الآخر بطرف ماصة كبير متصل بحامل الذبابة.

ثم اضغط على كمية صغيرة من الهواء من المحقنة لإخراج الذبابة إلى حامل الذبابة. انظر من خلال المجهر المجسم وقم بإدارة المزيد من الهواء برفق حتى يبرز رأس الذبابة من الطرف المخروطي لحامل الذبابة. تأكد من أن الذبابة محاصرة بقوة في صدرها.

ثم قم بتأمين الذبابة بشمع العسل. استخدم أدنى درجة حرارة لسخان الشمع لإذابة الشمع بشكل نظيف ، والذي سيبدو شفافا. إذا كان الجو حارا جدا ، فسوف يحترق الشمع.

شل حركة رأس الذبابة عن طريق وضع القليل من شمع العسل على خرطوم وزاوية العين اليمنى ، وتجنب القرنية. ثبت هاتين النقطتين لحامل الذبابة. قم بإنهاء هذه الخطوة بسرعة لتجنب حرق الذبابة.

بعد ذلك ، ارتد نظارات واقية وقم بتصنيع سكين صغير. قم بتثبيت شفرة حلاقة غير مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بحاملي شفرات مسطحين وقم بتكسير شريط صغير من حافتها الحادة. من الناحية المثالية ، قم بإنتاج حافة حادة تشبه البرج.

الآن ، بعناية وباهتمام كبير بالتفاصيل ، استخدم السكين الدقيق لفتح عدد قليل من أوماتيديا العين اليسرى للذبابة ، مثل أربعة إلى خمسة أوماتيديا من البشرة الظهرية فوق خط الاستواء للعين مباشرة. سيوفر هذا ممر للقطب الصغير للتسجيل. هذا يمثل تحديا كبيرا ، ويتطلب سكينا جيدا ، ويجب تعلمه بالممارسة.

ثم قم بإزالة قطعة القرنية الصغيرة برفق من الفتحة ، مع تعريض شبكية العين تحتها. الآن باستخدام الشعر الناعم لقضيب الفازلين ، قم بتغطية الحفرة بسرعة بنقطة صغيرة من الفازلين. يتمتع الهلام بفائدة إضافية تتمثل في تقليل السعة الداخلية للماصة.

تجنب تلطيخ العين لأن هذا يطمس البصريات. عند تشغيل مضخم القطب الصغير ، قم دائما بتأريض عن طريق لمس السطح المعدني لقفص فاراداي أو الطاولة المضادة للاهتزاز لمنع الشحنات الساكنة. قم بتأمين الذبابة المثبتة على عمود منصة إعداد الذبابة.

قم بتدوير حامل الذبابة بحيث تكون العين اليسرى للذبابة تواجه المحقق مباشرة. بعد ذلك ، استخدم مناور صغير للدورة لإدخال القطب المرجعي الحاد برفق من خلال أوسيلي الذبابة في كبسولة الرأس. تأكد من أن الذبابة لا تزال تبدو بصحة جيدة وتحركها على شكل قرون استشعار.

يجب أن يكون التحضير رائعا ليستحق التسجيل من. الآن قم بدفع قطب التسجيل الحاد إلى العين اليسرى من خلال الفتحة المطلية بالهلام. عند دخوله الأنسجة ، يجب أن يكون موقع طرف القطب واضحا من خلال نمط الانعكاس.

يجب توجيه طرف القطب الهش بشكل مثالي وإلا سينكسر ، وهو أمر صعب للغاية. اعتمادا على نوع الخلية التي يتم تسجيلها منها ، يجب أن يكون رأس الذبابة متجها بشكل مختلف قليلا. مع وضع الأقطاب الكهربائية في مكانها ، قم بتشغيل مضخم القطب الكهربائي الصغير.

ثم قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء البارد ، وافصله عن التيار الكهربائي ، وقم بتوصيله بالأرض المركزية لتقليل الضوضاء الكهربائية التي تسببها الحلقة الأرضية. بعد ذلك ، اضبط أدلة الضوء ذات الرأس المنحنية بحيث يمكن تحريك نظام ذراع Carden بحرية حول الذبابة. ثم أطفئ أضواء الغرفة لوضع تحضير الذبابة في ظلام نسبي.

الآن قم بقياس مقاومة قطب التسجيل في العين. يجب أن يتراوح بين 100 و 260 ميغا أوم. في بعض الأحيان يتم حظر الطرف ويمكن مسحه باستخدام وظائف الطنين السعوي لمكبر الصوت والنبض الحالي.

إذا لم يساعد ذلك ، فاستخدم قطبا كهربائيا جديدا. بعد ذلك ، اضبط مكبر الصوت على المشبك الحالي أو الجسر وصفر الجهد بين الأقطاب الكهربائية. بعد أن تتكيف الذبابة مع الظلام لبضع دقائق ، قم بدفع طرف قطب التسجيل في العين بخطوات 0.1 إلى ميكرون واحد باستخدام متدرج بيزو أو باستخدام دوران لطيف لمقبض الدقة الدقيقة.

في كل خطوة ، حفز العين بومضة ضوئية من واحد إلى 10 مللي ثانية. سيؤدي كل وميض ضوئي إلى انخفاض قصير في الجهد أو ERG. عندما يدخل طرف القطب إلى الصفيحة ، ويغلق على LMCs ، ينعكس ERG.

ثم تابع أخذ القياسات. نظرا لعدم التوغل ، يمكن دراسة أداء إشارة الخلايا الفردية في حالتها الطبيعية القريبة. تم قياس استجابة الجهد بواسطة المستقبلات الضوئية R1-R6 للضوء الخافت والساطع عند 20 درجة مئوية.

بعد ذلك ، تمت مقارنة المستقبلات الضوئية R1-R6 مع LMC عند 25 درجة مئوية. تم قياس كل منها على ذبابة مختلفة حيث أن التسجيلات داخل الخلايا بواسطة قطبين كهربائيين حادين في نفس الذبابة يصعب تطبيقها. تصبح قابلية تكرار الاستجابات واضحة عندما يتم تركيب البيانات.

تم الحصول على نسب الإشارة إلى الضوضاء في مجال التردد بأربع سنوات لتحويل أجزاء بيانات الإشارة والضوضاء إلى طيف قدرة ، ثم قسمة متوسط طيف قدرة الإشارة على متوسط طيف طاقة الضوضاء المقابل. يمكن أن تكون النتيجة حساسة للغاية للإشارات في أفضل الاستعدادات. يمكن استخدام هذه التقنية لتسجيل العديد من الأنواع.

تم إعطاء ذباب Coenocia نفس التحفيز الطبيعي المتكرر للضوء عند 19 درجة مئوية. تم أخذ البيانات قبل وبعد التشابك المشبكي من نفس الذبابة عن طريق تقدم قطب التسجيل. تتوافق الديناميكيات الأسرع للتسجيل مع الطبيعة المفترسة لهذا النوع.

بمجرد إتقانها ، تتيح هذه التقنية تسجيلات طويلة وعالية الجودة دائما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن ندرك ، أعني أنه يشبه تعلم العزف على البيانو. كلما تدربت أكثر ، ستحصل على نتائج أفضل.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التدخلات الدوائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل دور المعدلات العصبية في تشكيل الاستجابات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية العصبية لاستكشاف كيفية تحسين المعلومات الضوئية والتقاطها ونقلها ، بالإضافة إلى التفاعلات الكيميائية الحيوية الكاوية في آلية نقل الصور وفي العلوم البيولوجية التالية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ذبابة الفاكهة للتجارب داخل الخلايا وكيفية إيقاظ الاستجابات العصبية من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الداخلية.