حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

الهدف العام لهذا البروتوكول هو إثبات قابلية التطبيق العام لمحلل FRET في ظل الظروف المثلى من خلال تحديد محتوى السكر في المشروبات المتاحة تجاريا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال استشعار ومراقبة الجزيئات الصغيرة ، مثل السكر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تراقب بكفاءة إشارة جديدة تتفاعل عن الجزيئات الصغيرة بدون مقاييس فلورية باهظة الثمن وعالية الجودة.

الإجراء الدكتور هان من مختبرنا. أولا ، قم بإعداد بلازميد المستشعر الحيوي الفلوري الفلوري الخاص بالمالتوز أو السكروز الخاص. ثم قم بتلقيح خمسة ملليلتر من مرق لوريا بمستعمرة واحدة من DE3 E.Coli ، واحتضن الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لمدة 16 ساعة.

بعد ذلك ، ضع مليليتر واحد من المزرعة في قارورة تحتوي على 100 مل من LB. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.5. الطرد المركزي للثقافة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات بسرعة في 50 مل من الماء المقطر المثلج ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة مرة أخرى.

أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من محلول 10 بالمائة من الجلسرين والماء المقطر المثلج. حرك الخليط برفق حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 100. في كوفيت التثقيب الكهربائي المثلج ، امزج الخليط مع 10 نانوغرام من بلازميد CMY.

التثقيب الكهربائي الخليط. في الكوفيت ، أعد تعليق الخلايا في مليليتر واحد من وسط SOC ، ثم انقلها إلى أنبوب دائري القاع سعة 15 مل. استرجع الخلايا عن طريق رجها برفق عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة.

انشر الخلايا على صفيحة أجار LB مع 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين. احتضان الخلايا عند 37 درجة لمدة 12 ساعة. باستخدام حلقة ، انقل مستعمرة واحدة إلى 10 ملليلتر من LB تحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين.

احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مع رجه لمدة 12 ساعة لإنشاء ثقافة البذور. انقل خمسة ملليلتر من مزرعة البذور إلى 500 مل من LB مع الأمبيسلين ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة في حاضنة اهتزاز. بمجرد أن تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.5 ، أضف IPTG لعمل تركيز نهائي يبلغ 0.5 ملليمول.

بعد احتضان الثقافة لمدة 24 ساعة ، قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم. قم بتبريد الخلايا على الجليد لمدة 10 ثوان ، ثم قم بتبريد الخلايا لمدة 10 ثوان.

كرر الصوتنة والتبريد خمس مرات أخرى. الطرد المركزي المحللة لمدة 30 دقيقة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب تجميع آخر.

تنقية المادة الطافية على عمود تقارب NTA من النيكل. املأ مكثفا 10 ، 000 مللي واط ب 20 مل من العينة المنقاة. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق ، ثم أعد ملء المكثف بمحلول ملحي مخزن ب 0.8٪ من الفوسفات.

كرر هذه العملية مع بقية العينة بهذه الطريقة ، 20 مل في المرة الواحدة ، حتى يتم تركيز كل البروتين وتحلىه. قم بتخزين المستشعر الحيوي FRET المنقى عند 80 درجة مئوية. قم بإعداد محلول 0.2 ميكرومولار من بروتين المستشعر الحيوي CMY و 0.8٪ PBS كحل للكشف.

قم بتشغيل محلل FRET المحمول باليد. اضبط درجة حرارة التحليل على 53 درجة مئوية. ثم اضبط الجهاز على وضع المعايرة.

املأ كوفيت ب 0.8٪ PBS كخلفية. سخن العينة مسبقا إلى 53 درجة مئوية في المحلل ، ثم اضبط الخلفية. بعد ذلك ، املأ الكوفيت بمحلول الكشف.

ضع الكوفيت في المحلل واضبط خط الأساس. استبدل الكوفيت بمحلول يحتوي على محلول كشف وسكر مليمول. اضبط الشدة عند التشبع لإنهاء المعايرة.

لبدء تحضير عينة من المشروبات لتحليل محتوى السكر ، باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، قم بعمل جهاز طرد مركزي واحد من المشروبات. قم بإزالة المادة الطافية بحقنة سعة ملليلتر واحد وقم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. اجمع بين 0.1 مل من المرشح و 0.9 مل من 0.8٪ PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.

قم بدوامة الخليط برفق لضمان التخفيف الكامل. ضع خمسة ميكرولترات من عينة المشروبات المخففة و 495 ميكرولترا من محلول الكشف في كوفيت. ضع الكوفيت في المحلل وقم بتسخين العينة مسبقا إلى 53 درجة مئوية.

اضغط على زر الضبط لقياس محتوى السكر في العينة. في هذه الطريقة ، يتم قياس كفاءة FRET من خلال نسبة شدة انبعاث البروتين الفلوري الأصفر إلى البروتين الفلوري السماوي في المستشعر الحيوي. تتراوح درجة حرارة القياس المثلى لأجهزة الاستشعار الحيوية CMY بين 50 و 55 درجة مئوية ، حيث يكون الفرق في نسبة شدة الانبعاث بين محلول التحكم والمحلول المشبع من المالتوز أكبر.

تم استخدام المستشعر الحيوي CMY-BII لتقييم محتوى المالتوز لثلاثة مشروبات عند 53 درجة. يتم إنشاء منحنى استجابة الجرعة من الحصول على هذه النسبة بتركيزات مختلفة من المالتوز عند درجة حرارة معينة. ترتبط نسبة الانبعاث بتركيز المالتوز باستخدام القيم التي تم الحصول عليها أثناء المعايرة.

يتم عرض محتويات المالتوز المقاسة مع إجمالي محتويات السكر التي أبلغت عنها الشركات المصنعة للمشروبات. يحتوي المشروب أ على مصادر المالتوز مثل الأرز والشعير. في المقابل ، تمثل الكمية المرصودة من المالتوز حوالي نصف إجمالي محتوى السكر المبلغ عنه.

يحتوي المشروب C ، وهو مشروب رياضي ، على نسبة منخفضة جدا من المالتوز. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تشغيل الجهاز ومستشعرات FRET بين 50 و 55 درجة مئوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مثل هذه الجزيئات الصغيرة باستخدام محلل FRET محمول حسب الطلب.