حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إثبات القابلية العامة لتطبيق محلل FRET في ظل الظروف المثلى من خلال تقدير كمية السكر في المشروبات المتاحة تجارياً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال استشعار ومراقبة الجزيئات الصغيرة، مثل السكر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على مراقبة استجابة إشارة حديثة للجزيئات الصغيرة بكفاءة دون الحاجة إلى أجهزة قياس الفلورة الباهظة وعالية الجودة.

سيقوم الدكتور Han من مختبرنا بتوضيح الإجراء. أولاً، قم بتحضير بلازميد المستشعر الحيوي الفلوري باللونين السماوي والأصفر الخاص بالمالتوز أو السكروز. بعد ذلك، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من مرق Luria بمستعمرة واحدة من بكتيريا DE3 E.Coli، واحضن المزرعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هزازة لمدة 16 ساعة.

بعد ذلك، ضع 1مل من المزرعة في دورق يحتوي على 100مل من LB. قم بتحضين الدورق عند 37°C في حاضنة هزازة حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600nm إلى حوالي 0.5. قم بطرد المزرعة مركزياً لمدة 20 دقيقة عند 4°C. أعد تعليق الراسب بسرعة في 50مل من الماء المقطر المبرد بالثلج، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 دقيقة.

أعد تعليق الراسب في 50 µL من محلول يتكون من 10% حجمياً من الجلسرول والماء المقطر المبرد بالثلج. قم برج الخليط بلطف حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 100. في كوفيت توصيل كهربائي (electroporation cuvette) مبرد بالثلج، اخلط المزيج مع 10 ng من بلازميد CMY.

قم بإجراء التثقيب الكهربائي للخليط. في الكيوفيت، أعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من وسط SOC، ثم انقلها إلى أنبوب مستدير القاع سعة 15 milliliter. استعد الخلايا عن طريق الرج اللطيف عند 37 degrees لمدة ساعة واحدة.

انشر الخلايا على طبق أجار LB يحتوي على 100 µg/mL من الأمبيسيلين. حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لمدة 12 ساعة. وباستخدام عروة تلقيح، انقل مستعمرة واحدة إلى 10 mL من وسط LB الذي يحتوي على 100 µg/mL من الأمبيسيلين.

يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 12 ساعة لإنشاء المزرعة البذرية. يُنقل 5 milliliters من المزرعة البذرية إلى 500 milliliters من وسط LB المحتوي على الأمبيسيلين، وتُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة هزازة. وبمجرد وصول الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.5، يُضاف IPTG للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.5 millimolar.

بعد تحضين المزرعة لمدة 24 ساعة، قم بЦентrifuge الخلايا لمدة 20 دقيقة. أزل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في خمسة ملليلتر من محلول الارتباط المنظم. قم بعمل سونيكة للخلايا على الثلج لمدة 10 ثوانٍ، ثم برد الخلايا لمدة 10 ثوانٍ.

كرر عمليتي السونكة والتبريد خمس مرات إضافية. قم بطرد المستخلص مركزيًا لمدة 30 minutes. انقل السائل الطافي إلى أنبوب تجميع آخر.

قم بتنقية السائل الطافي باستخدام عمود تقارب النيكل NTA. املأ جهاز تركيز بسعة 10,000 milliwatt بـ 20 milliliters من العينة المنقاة. قم بطرد العينة مركزياً لمدة 10 minutes، ثم أعد ملء جهاز التركيز بـ 0.8% phosphate buffered saline.

كرر هذه العملية مع بقية العينة بهذه الطريقة، بمعدل 20 milliliters في المرة الواحدة، حتى يتم تركيز وإزالة الأملاح من جميع البروتينات. يُخزن مستشعر FRET الحيوي المنقى عند 80 درجة Celsius. قم بتحضير محلول بتركيز 0.2 micromolar من بروتين مستشعر CMY الحيوي و 0.8%PBS كمحلول للكشف.

قم بتشغيل جهاز تحليل FRET المحمول. اضبط درجة حرارة التحليل على 53 °C. ثم اضبط الجهاز على وضع المعايرة.

املأ خلية قياس (cuvette) بمحلول 0.8%PBS كخلفية. قم بتسخين العينة مسبقًا إلى 53 درجة مئوية في جهاز التحليل، ثم اضبط الخلفية. بعد ذلك، املأ خلية قياس بمحلول الكشف.

ضع الكيوفيت في المحلل ثم اضبط خط الأساس. استبدل الكيوفيت بأخرى تحتوي على محلول الكشف و1 mM من السكر. اضبط الشدة عند نقطة التشبع لإتمام عملية المعايرة.

لبدء تحضير عينة من المشروب لتحليل محتوى السكر، قم بطرد مركزي لـ 1 milliliter من المشروب باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. اسحب السائل الطافي باستخدام سرنجة سعة 1 milliliter وقم بترشيحه عبر مرشح سرنجة بمسامية 0.2 micrometer. اخلط 0.1 milliliters من الراشح مع 0.9 milliliters من 0.8%PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.

قم برج الخليط بلطف باستخدام جهاز الفورتيكس لضمان التخفيف الكامل. ضع خمسة 5 µL من عينة المشروب المخففة و 495 µL من محلول الكشف في كيوفيت. ضع الكيوفيت في جهاز التحليل وسخن العينة مسبقاً إلى 53 °C.

اضغط على زر الضبط (set) لقياس محتوى السكر في العينة. في هذه الطريقة، يتم قياس كفاءة FRET عن طريق نسبة شدة انبعاث البروتين الفلوري الأصفر إلى البروتين الفلوري السماوي في المستشعر الحيوي. وتتراوح درجة حرارة القياس المثلى لهذه المستشعرات الحيوية من نوع CMY بين 50 و 55 درجة Celsius، حيث يكون الفرق في نسبة شدة الانبعاث بين المحلول الضابط ومحلول المالتوز المشبع في أقصى حدوده.

استُخدم المستشعر الحيوي CMY-BII لتقييم محتوى المالتوز في ثلاثة مشروبات عند درجة حرارة 53 °C. ويتم إنشاء منحنى الاستجابة للجرعة من خلال الحصول على هذه النسبة عند تركيزات مختلفة من المالتوز في درجة حرارة محددة. وترتبط نسبة الانبعاث بتركيز المالتوز باستخدام القيم التي تم الحصول عليها أثناء عملية المعايرة.

تظهر محتويات المالتوز المقاسة مع إجمالي محتويات السكر التي أبلغت عنها الشركات المصنعة للمشروبات. احتوى المشروب A على مصادر للمالتوز مثل الأرز والشعير. وبناءً على ذلك، فإن كمية المالتوز الملحوظة تمثل حوالي نصف إجمالي محتوى السكر المبلغ عنه.

احتوى المشروب C، وهو مشروب رياضي، على محتوى منخفض جداً من المالتوز. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تشغيل الجهاز ومستشعرات FRET في درجة حرارة تتراوح بين 50 و 55 درجة Celsius. وبعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس كمية مثل هذه الجزيئات الصغيرة باستخدام محلل FRET محمول مُصمم خصيصاً.