تسجيل وقت واحد من تخطيط كهربية الشبكية والإمكانيات البصرية مستدعى في الفئران تخدير
July 1st, 2016
يصف هذا البروتوكول القياس المتزامن لمخطط كهربية الشبكية والإمكانات البصرية المستحثة في الفئران المخدرة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس المجام الكهربائي والشبكية والإمكانيات البصرية في الفئران في نفس الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب الشق. مثل ما إذا كان تأثير الشيخوخة أو الأمراض يؤثر على مكونات معينة في المسار البصري.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم شامل لوظيفة الشبكية وتأثيرها الأولي على الوظيفة القشرية المستحثة بصريا. لبدء هذا الإجراء ، قم بتصميم أقطاب ERG غير النشطة المصنوعة خصيصا عن طريق قطع سلك فضي بطول 70 ملم وتشكيل حلقة قطرها ثمانية ملليمترات لتطويق عين الجرذ. قم بإعداد دائرة موحدة واضبط حجم الحلقة عن طريق تشكيلها على طرف رأس أنبوب بطول ملم واحد.
هذا مهم لأن الحلقة الصغيرة جدا قد ترفع الضغط المفصلي عن غير قصد ، حيث يمكن أن تزيد الحلقة كبيرة الحجم من تباين الإشارات. بعد ذلك ، قم بتصميم القطب الكهربائي غير النشط VEP المصنوع خصيصا عن طريق قطع الفضة بطول 70 ملم. وتشكيل قطع ناقص يبلغ قطره ثمانية ملليمترات لتثبيته على قواطع الفئران.
بعد ذلك ، قم بتصميم الأقطاب الكهربائية النشطة ERG المصنوعة خصيصا عن طريق قطع سلك فضي بطول 30 ملم وتشكيل حلقة صغيرة يبلغ قطرها حوالي ملليمتر إلى ملليمترين والتي تستخدم للاتصال برفق بقرنية الفئران مع الحد الأدنى من سحجات القرنية. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بإحكام بأسلاك القطب الكهربائي عن طريق ربط الفضة بالسلك الداخلي المكشوف. اعزل المعدن المكشوف الزائد بشريط لاصق لتقليل القطع الأثرية الكهروضوئية.
بالنسبة للأقطاب الكهربائية النشطة ERG ، يمكن تطبيق المزيد من طبقات الشريط اللاصق لتحقيق غلاف أكثر سمكا وصلابة بحيث يسهل حمل القطب باستخدام مناور دقيق. على كل قطب كهربائي غير نشط ERG ، قم بلصق قطعة صغيرة من قفل الخطاف والحلقة بشريط التقنيع لتمكين التثبيت الثابت بحزام عنق القوارض. بعد ذلك ، لكل قطب كهربائي نشط VEP ، قم بتوصيل مشبك التمساح بالسلك الداخلي لسلك القطب.
مباشرة قبل التسجيلات ، قم بطلاء الأسطح المكشوفة للأسلاك الفضية بالكلوريد لتحسين توصيل الإشارة. للقيام بذلك ، قم بتوصيل الكاثود بالطرف السالب للبطارية واغمر الطرف الآخر في المحلول الملحي. بعد ذلك ، اغمر الطرف الفضي على سلك الأنود في محلول ملحي عادي وقم بتوصيل الطرف الآخر من سلك القطب هذا ، بالطرف الموجب لبطارية تسعة فولت.
افصلها بعد 20 ثانية ويجب طلاء الطرف الفضي لسلك القطب بالتساوي باللون الأبيض. كرر إجراء المعالجة بالكلور لجميع أقطاب ERG و VEP الفضية. في هذا الإجراء ، قم بتطهير المنطقة المحلوقة للحيوان المخدر باستخدام 10٪ بوفيدون اليود ثلاث مرات.
قم بعمل شق سهمي على طول خط الوسط على الرأس بمشرط واستئصال دائرة قطرها 20 ملم من الأنسجة الجلدية لكشف عظم الجمجمة. بعد ذلك ، قم بإزالة السمحاق الأساسي عن طريق الكشط والتجفيف بالشاش ، لفضح الغرز القحفية الإكليلية والسهمية. احفر فتحتين من خلال الجمجمة على نصفي الكرة الأرضية.
قم بربط مسامير من الفولاذ المقاوم للصدأ في الفتحتين المعدة مسبقا حتى عمق ملليمتر واحد للسماح بالتثبيت الثابت. بعد ذلك ، قم بإعداد المنطقة الجراحية لملغم الأسنان عن طريق تجفيف عظم الجمجمة بالشاش وسحب الجلد بخرزتين. بعد ذلك ، انشر ملغم الأسنان على الجمجمة المكشوفة لتثبيت الأقطاب الكهربائية اللولبية في مكانها والتأكد من تعرض حوالي 1.5 ملم من البراغي للتسجيل.
بعد ذلك ، قم بإزالة خيوط التراجع. بالنسبة للتسجيلات الاسكتلندية ، يتم تنفيذ جميع الإجراءات في غرفة مظلمة. لأغراض التوضيح ، يتم إجراء تحديد موضع القطب الكهربائي تحت إضاءة الغرفة العادية هنا.
كان مظلما قبل 12 ساعة وتم تخديره بالكيتامين والزيلازين. بعد توسيع حدقة العين والتخدير الموضعي ، قم بربط قطب VEP غير النشط حول القواطع السفلية. بعد ذلك ، ضع على منصة ERG أمام وعاء Ganzfeld الموجود في قفص فاراداي.
قم بتأمين على المنصة بشريط من قفل الخطاف والحلقة الموضوعة بإحكام ولكن ليس بإحكام حول مؤخرة العنق. بعد ذلك ، ضع أقطاب ERG غير النشطة عن طريق تطويق الحلقة السلكالية بشكل غير جراحي حول خط الاستواء للعينين. حوالي ثلاثة أمتار خلف الطرف.
قم بتثبيت ذلك عن طريق توصيل القطب الكهربائي بشريط قفل الخطاف والحلقة حول مؤخرة العنق. كرر الإجراء للعين المقابلة. الآن ، اربط أقطاب VEP النشطة عن طريق ربط مشابك التمساح بمسامير الفولاذ المقاوم للصدأ ، المزروعة مسبقا على الجمجمة.
قبل وضع القطب الكهربائي النشط ERG ، ضع قطرة صغيرة من 1٪ كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القطب لتحسين جودة الإشارة. ضع الأقطاب الكهربائية النشطة ERG للمس سطح القرنية المركزي برفق باستخدام مناور دقيق متصل بالذراع التجسيمي المصمم خصيصا. تأكد من أن كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم يلامس القرنية فقط وليس السلارا ، عن طريق مسح السوائل الزائدة بعيدا.
ثم أدخل ملليمترين إلى خمسة ملليمترات من قطب الإبرة الأرضية المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ ، تحت الجلد في الذيل. حرك المنصة بالقرب من وعاء Ganzfeld وتأكد من محاذاة عيون مع فتحة الوعاء لتمكين الإضاءة المتساوية لشبكية العين. بعد ذلك ، أغلق قفص فاراداي لتقليل الضوضاء الدخيلة.
باستخدام البروتوكول أعلاه ، يمكن تسجيل كومة من أشكال موجات ERG استجابة لمجموعة من المحفزات مع عرض الوميض الأكثر تعتيما في الأسفل والأكثر سطوعا في الأعلى. عند مستويات الضوء الخافتة جدا ، يمكن تسجيل استجابات عتبة سكوتوبية. مع زيادة سطوع التحفيز ، تهيمن الموجة B على أشكال الموجة ثم تظهر الموجة السالبة A عند ألمع المحفزات.
يمكن فحص وظيفة المستقبلات الضوئية للقضيب باستخدام P3 لنمذجة الموجة A. يوضح هذا الشكل أن سعة P2 تنمو مع زيادة طاقة التحفيز. يمكن فحص وظيفة الخلية ثنائية القطب من خلال نمذجة نظريات استجابة الشدة للقضيب P2 بوظيفة ناكا رشتين.
يتم فحص وظيفة الخلية العقدية الشبكية عند الطاقات المضيئة الخافتة ويتم قياسها كميا من خلال سعة ذروة pSTR وتوقيتها. يتم استنباط وظيفة الخلية المخروطية ثنائية القطب من خلال نموذج فلاش مزدوج ويتم قياسه كميا بواسطة سعة ذروة المخروط P2 وتوقيته. يؤخذ تحليل سعة VEP على أنه ذروة السعة و troph إلى ذروة السعات التي تعطي توقيت هذه الاستجابات.
يتشكل اتساع موجة VEP مع زيادة طاقة التحفيز. عندما يتم إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 30 إلى 45 دقيقة باستثناء وقت تحضير القطب ووضع القطب الكهربائي والتكيف. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم بشكل خاص الانتباه إلى مدى دقة وضع الأقطاب الكهربائية وإتاحة الوقت الكافي للتكيف.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء إجراءات أخرى مثل تعديل المرض أو العلاجات للإجابة على أسئلة محددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الأقطاب الكهربائية ووضعها وكذلك كيفية تسجيل وتحليل أشكال موجات ERG و VEP.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول القياس المتزامن للمخطط الكهربائي للشبكية والإمكانات المثارة بصريًا في الجرذان المخدرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب للشقوق، خاصة فيما يتعلق بتأثيرات الشيخوخة أو الأمراض على المسار البصري.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- المعالجة البصرية
الخلفية
- يقيس المخطط الكهربائي للشبكية (ERG) وظيفة الشبكية.
- تقييم الإمكانات المثارة بصريًا (VEP) يقيّم المعالجة البصرية القشرية.
- فهم مكونات المسار البصري أمر بالغ الأهمية لأبحاث علم الأعصاب.
- يمكن أن تؤثر الشيخوخة والمرض على الوظيفة البصرية.
غرض الدراسة
- قياس ERG و VEP بشكل متزامن في الجرذان.
- تقييم تأثير الشيخوخة والأمراض على المسارات البصرية.
- تقديم تقييم شامل لوظائف الشبكية والقشرية.
الطرق المستخدمة
- إعداد أقطاب ERG مخصصة باستخدام سلك الفضة.
- وضع الأقطاب حول عين الجرذ.
- التسجيل المتزامن لإشارات ERG و VEP.
- تحليل البيانات لتقييم الوظيفة البصرية.
النتائج الرئيسية
- قياس ناجح لكل من ERG و VEP في الجرذان المخدرة.
- تحديد التغييرات في مكونات المسار البصري بسبب الشيخوخة أو المرض.
- إظهار فعالية الأسلوب في التقييم البصري الشامل.
- ملاحظات حول التفاعلات الشبكية والقشرية في المعالجة البصرية.
الخلاصات
- تتيح هذه التقنية الدراسة التفصيلية للوظيفة البصرية في نماذج الحيوانات.
- يمكن أن تساعد في توضيح تأثيرات عوامل مختلفة على المسارات البصرية.
- يمكن أن يوسع البحث الإضافي فهم المعالجة البصرية في الصحة والمرض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Simultaneous ERG and VEP recording enables comprehensive assessment of retinal-to-cortical visual pathway integrity in preclinical models. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking by linking retinal dysfunction to upstream cortical effects, informing target validation in neurodegenerative and ophthalmic disease research. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, translatable electrophysiological readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating retinal electrophysiological changes with cortical visual processing deficits.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of retinal and visual pathway responses to light stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate specific visual pathway components (e.g., rod bipolar, retinal ganglion cell function).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline retinal and cortical electrophysiological profiles.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs (e.g., P2 amplitude, pSTR peak) for reliable compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across disease models due to consistent electrode preparation and signal acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by assessing disease-relevant visual pathway alterations from retina to cortex.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through amplitude and timing analysis of ERG and VEP waveforms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether retinal changes drive cortical dysfunction or occur independently, reducing false positives in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing electrophysiological biomarkers of visual pathway integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect retinal neuronal and glial cell class responses.
- Screening: Enables assay readiness via stable, low-noise signal acquisition after electrode chloridation and proper dark adaptation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ERG A/B waves, VEP peak-to-peak amplitude) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling retinal ganglion and cone bipolar cell function using established intensity-response paradigms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for chronic studies due to stable electrode implantation and standardized recording parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing retinal versus cortical contributions to visual deficits.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed electrode preparation (silver wire chloridation, loop sizing) and placement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional visual pathway outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on dose-responsive changes in scotopic threshold responses and VEP amplitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and electrode fabrication for stable signal acquisition.
- Depends on instrumentation including Ganzfeld stimulator, Faraday cage, micro-manipulator, and differential amplifiers.
- Necessitates cross-team standardization of dark adaptation protocols and stimulus intensity ranges for reproducible data.
- Involves adaptation considerations across rodent strains and anesthesia regimens affecting pupil dilation and corneal sensitivity.
- Practical limitations include signal variability from improper electrode sizing or inadequate chloridation, as noted in the protocol.
