تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

الهدف العام من هذه التقنية هو معالجة الأجزاء الطويلة من أنسجة الأمعاء الفأرية بكفاءة من أجل تلطيخ نسيجي موحد على طولها. للحصول على أقسام الأمعاء ، يمكن أن تكون هناك اختلافات في التلوين على طول الأمعاء بالكامل. حاولت استخدام تقنية الدرفلة السويسرية القياسية ولكني وجدت أنها تنتج أنسجة معوية شديدة الصلابة وليس من السهل فتحها.

مع بعض التجارب ، توصلت إلى طريقة تثبيت سريعة تستخدم مواد كيميائية أقل سمية وتسمح بتدوير الأنسجة المعوية بشكل أفضل في السويسري. يمكن استخدام المثبت المعدل لإصلاح الأنسجة السميكة الأخرى بسرعة. في التحضير ، قم بالقتل الرحيم لحيوان الاختبار وفقا لبروتوكول النص وتجهيز الإعداد الجراحي.

للبدء ، استخدم ملقط التشريح والمقص لعمل شق جانبي في منتصف البطن حوالي سنتيمتر إلى سنتيمترين تحت القفص الصدري اعتمادا على حجم الفأر. ثم قم بتفكيك الجلد برفق وقطعه لكشف عضلات البطن. بعد ذلك ، أمسك العضلات وسحبها دون الإمساك بالأمعاء أو سحبها.

بعد ذلك ، قم بعمل شق أولي بعناية في عضلات البطن وقطعها بعناية لفضح الأمعاء. الآن حدد القولون وتتبعه إلى نهايته البعيدة حيث ينضم إلى المستقيم. ثم باستخدام المقص ، قم بتمرير القولون بالقرب من فتحة الشرج قدر الإمكان.

بعد ذلك ، ابحث عن مكان انضمام المعدة إلى الأمعاء الدقيقة وباستخدام المقص ، قم بتحرير الأمعاء على بعد حوالي سنتيمتر واحد من المعدة. الآن انقل طول الأمعاء الدقيقة والقولون الحرة بالكامل إلى طبق بتري نظيف يحتوي على PBS. بعد ذلك ، قم بتأمين الطرف البعيد للقولون وقم بفك طول القولون بالكامل برفق ، وإزالة أي أنسجة مساريقية متصلة.

ثم حدد الأعور ، وقم بتمرير الأمعاء حيث ينضم الأعور إلى القولون ، وبالتالي عزل القولون. وبالمثل ، قم بكشف بقية الأمعاء الدقيقة من الأنسجة الضامة والمساريقية والدهنية المرفقة. ثم قم بتمرير الأمعاء الدقيقة حيث تنضم إلى الأعور.

يمكن بعد ذلك إزالة الأعور والتخلص منه. الآن املأ حقنة سعة 10 ملليلتر بمثبت Bouin المعدل وقم بإرفاق إبرة تزقيم. أدخل الإبرة حوالي نصف سنتيمتر في الفتحة الأمامية لجزء معوي.

أثناء تأمين إبرة التزقيم بإحكام داخل الجزء ، قم بغسل محتويات الأنسجة ببطء باستخدام المثبت. كن حذرا ، لأن الضغط الشديد سوف ينفجر الجزء. إذا بدت الأمعاء الدقيقة طويلة جدا بحيث لا يمكن التعامل معها ، فقد ترغب في تقطيعها إلى ثلاثة أجزاء متساوية أولا وغسل كل جزء على حدة.

سيؤدي التثبيت إلى أن يصبح لون الجزء المعوي معتما. بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بقص القطعة طوليا على طول الخط المساريقي ثم اشطف الجزء لفترة وجيزة في طبق من PBS مع إبقائه مفتوحا بالملقط. الآن قم بتقطيع الأمعاء الدقيقة إلى ثلاثة أجزاء متساوية ، قريبة ومتوسطة وبعيدة ، والتي تتوافق تقريبا مع الاثني عشر والصائم والدقاق.

من الناحية المجهرية ، لا توجد ميزات مميزة لكل قسم. تأكد من وضع علامة لتحديد القريب من الطرف البعيد في كل جزء. ثم ضع قطعة بحيث يكون الجانب اللومنال متجها لأعلى على غطاء طبق بتري.

في الجزء القولوني ، حدد الجانب اللومن من خلال النتوءات التي تمتد عبر عرضه عند الطرف القريب. تحتوي المناطق الوسطى والبعيدة على بعض التنوع الذي يمتد طوليا. على الأمعاء الدقيقة ، حدد الجانب اللومن من خلال السطح الخشن الذي يميز الزغابات.

يظهر الفحص المجهري أن الزغابات هي الأطول في المناطق القريبة من كل جزء ، في حين أن الخبايا القولونية هي الأقصر في المناطق القريبة وتكون في أعلى حالاتها في القسم الأوسط. استمر في التدحرج السويسري للقولون. مع فتح القولون بشكل مسطح والجانب اللوميني لأعلى ، اسحبه بالملقط من نهايته القريبة باتجاه حافة طبق بتري.

حافظ على الجانب اللوميني لأعلى ، أمسك الطرف القريب بالملقط ولف حافة الطرف القريب حول عود أسنان واضغط بإحكام على الحافة الملفوفة على عود الأسنان. ثم قم بلف القولون برفق وببطء حول عود الأسنان لتشكيل لفافة سويسرية بمجرد لف طول القولون بالكامل ، استخدم زوجا آخر من الملقط لتحريك اللفة بعناية في كاسيت معالجة الأنسجة.

ثم انقل الكاسيت إلى فورمالين مخزن بنسبة 10 في المائة واتركه يحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. لدحرجة جزء من الأمعاء الدقيقة السويسرية ، افتحها الجانب اللوميني لأعلى واسحبها بالملقط من نهايته القريبة باتجاه حافة الطبق. ثم استخدم نفس التقنية كما هو موضح مع القولون لعمل اللفة السويسرية وإصلاحها بالفورمالين.

باستخدام الطرق الموصوفة ، كشف تلطيخ HND للأمعاء الغليظة للفأر الأسود C57 6 عن جميع أجزاء القولون لإجراء تقييم نسيجي شامل. بعد ذلك ، تم استخدام المستحضر للفئران التي تعبر عن EGFP مدفوعا بمحفز LGR5 الذي ينشط فقط في الخبايا المعوية المحيطية. يحتوي هذا الجين المعدل EGFP على اختراق يبلغ حوالي 5 إلى 10 في المائة فقط ، ولكن يمكن العثور بسهولة على مناطق الاهتمام.

باستخدام نفس الفئران مع تعبير EGFP LGR5 ، تم تلطيخ KLF5 و KI67. تمت دراسة الفئران الضابطة الأولى ذات التعبير الطبيعي LGR5. يتم تمييز الخلايا الموجبة ل EGFP بأسهم زرقاء ويتم تمييز الخلايا السالبة EGFP بأسهم بيضاء.

ثم تم التعبير عن نفس الجينات المعدلة وراثيا في فأر KLF5 بالضربة القاضية. التلوين المشترك ل KLF5 و KI67 مفقود في الخلايا الجذعية الإيجابية EGFP ، لكنه لا يزال موجودا في الخبايا السالبة EGFP. من الواضح أن جودة التحضير لتلوين قوة الفلورو المتعددة جيدة جدا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 15 دقيقة لكل فأر إذا كنت تجمع كل من الأمعاء الدقيقة والقولون. لا تنس أن العمل باستخدام مثبت بوين يمكن أن يكون خطيرا للغاية على العينين. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل الحماية المناسبة للعين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

شكرا لك على المشاهدة والنظرة الجيدة لتجاربك.