جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية

الهدف العام من إجراء عملية زرع الخلايا الجذعية الجراحية هذه هو إنشاء نموذج فأر خيمري جديد يتمتع بوظائف كبد بشرية باستخدام خلايا سلفية جذعية كبدية بشرية غير ناضجة، مما يسمح بتكاثر الخلايا ونضجها وتمايزها لاكتساب القدرة على استقلاب الأدوية. توفر هذه الطريقة أداة قوية لإنشاء بيئة دقيقة تدعم تكاثر الخلايا السلفية الجذعية الكبدية للمانح البشري لكي تتوسع وتتمايز وتعيد بناء كبد الفأر المستقبل المصاب. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدام الخلايا المتكاثرة الناضجة، وفيما أن الكبد يعيد استيطان الخلايا بشكل شبه كامل.

للبدء، قم بتحضير محلول مخزون من ذيفان الدفتيريا (DT) بتركيز 1 mg/mL عن طريق إضافة 1 mL من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.85% المضاف إليه الفينول إلى 1 mg من DT. قم بإجراء حقن داخل الصفاق لـ DT عن طريق تثبيت فأر albtrek scid في وضعية الاستلقاء الظهري، وأدخل الإبرة بزاوية 45 درجة بالنسبة للجسم أسفل ثنية الركبتين على يسار أو يمين الخط الناصف. باستخدام سرنجة إنسولين، احقن 100 µL من محلول DT المحضر حديثاً بتركيز 0.3 µg/mL لكل فأر يزن 20 g. بعد مرور 48 ساعة من حقن DT، ضع الفأر في أداة تثبيت وقم بتدفئة الذيل في حمام مائي بدرجة حرارة 30 °C لمدة 10 دقائق تقريباً لتوسيع الأوعية الدموية.

بعد ذلك، وعلى بُعد سنتيمترين من طرف الذيل، استخدم شفرة مشرط حادة لإحداث خدش بطول 1 ملم في الذيل، واستخدم أنبوبًا شعريًا لجمع الدم. قم بطرد مركزي للأنبوب الشعري الدقيق الذي يحتوي على الدم عند 1500 ×g لمدة خمس دقائق، ثم اجمع المصل عن طريق فصل السائل الطافي عن الرواسب الخلوية. اسحب 50 µL من تخفيف 1 إلى 20 للمصل باستخدام الماصة وضعها على شرائح GOT ASTP3.

بعد ذلك، وباستخدام محلل كيميائي جاف أوتوماتيكي متعدد الأغراض وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، قم بقياس امتصاصية ناتج التفاعل عند 650 nanometers. وباستخدام فارز الخلايا، قم بعزل الخلايا الجذعية الكبدية البشرية من خلايا الكبد الجنينية البشرية الأولية التي تحمل المستضدات الخلوية CDCP1 وCD90 وCD66 للحصول على مجموعة فرعية تكون موجبة لـ CDCP1، وموجبة لـ CD90، وسالبة لـ CD66. ازرع الخلايا في أطباق زراعة مغلفة بكولاجين النوع الرابع وحضنها عند 37 °C.

عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90%، استخدم PBS لغسل الخلايا مرة واحدة. ثم أضف 0.05% Trypsin EDTA واحضنها في درجة حرارة الغرفة. عندما تظهر الخلايا عائمة أو تتدفق بحرية تحت المجهر، أوقف الهضم الإنزيمي بإضافة ثمانية مليليترات من DMF12 المحتوي على 10% FBS.

باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter، قم بتعليق الخلايا ببطء قبل نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 100 ×g ودرجة حرارة أربعة °C لمدة خمس دقائق. وباستخدام 10 milliliters من DMF12 مع 10% FBS، قم بإعادة تعليق الكتلة الخلوية بعناية، واستخدم جهاز عد الخلايا لتحديد أعدادها.

قسّم الخلايا إلى حصص مقدار كل منها 1×10⁶ خلية لكل 50 µL من PBS لكل فأر، واحفظها على الثلج حتى عملية الزرع. بعد تخدير الفأر وفقاً للبروتوكول المكتوب، تحقق من وجود رد فعل منعكس عن طريق قرص وسادة القدم الخلفية برفق. ثم ضع مرهم بيطري على العينين لمنع الجفاف.

باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية، قم بحلاقة موقع الجراحة ثم ضع 70%ethanol والـ povidone-iodine للتطهير. قم بعمل شق جلدي بطول واحد سنتيمتر في الخاصرة اليسرى أسفل الحافة الضلعية مباشرةً. ثم قم بعمل شق في جدار البطن الأيسر يليه شق في الصفاق.

بعد ذلك، قم بكشف الطحال بعناية. ثم وبزاوية مقدارها 5 درجات، أدخل سرنجة حقن مجهري سعة 100 µL مع إبرة قياس 32 gauge وطول 1/2 بوصة، على عمق يعادل نصف سمك الطحال، وقم بحقن 1×10⁶ من الخلايا الجذعية الكبدية البشرية في 50 µL من PBS مباشرة من أحد طرفي العضو إلى الطرف الآخر، ثم اسحب الإبرة. ولمنع تسرب الخلايا بعد الحقن، استخدم الإصبع لتطبيق ضغط خفيف لمدة دقيقتين.

أعد الطحال إلى جسم الفأر واستخدم غرزة جراحية مستمرة عادية لعضلات الجلد لإغلاق التجويف. انقل الفأر فوراً وهو على جانبه إلى قفص مُدفأ مسبقاً عند درجة حرارة 37 degree Celsius. تجنب التلامس بين فرشة القفص وموقع الجراحة، وراقب الحيوان وفقاً للبروتوكول المكتوب.

بعد مرور أربعة إلى ستة أسابيع من عملية الزرع، وبعد قتل الفأر رحمةً وفقاً للبروتوكول المذكور، استخدم مقصاً جراحياً لفتح التجويف البطني عن طريق قص الجلد واللفافة في آن واحد. وباستخدام المقص كمباعد، قم بتشريح النسيج الضام الموجود فوق الصفاق على طول الخط الأبيض لفتح التجويف الصفاقي. ثم ارفع عظمة القص باستخدام الملقط.

بعد ذلك، قم بثقب الحجاب الحاجز والقطع عبر كل جانب من عظم القص وصولاً إلى الحزام الترقوي. اقطع الوريد الأجوف في الجانب الصدري من الكبد، ثم اسحب المريء عبر الكبد في الاتجاه الأمامي. قم بإزالة الحجاب الحاجز، ثم استخدمه كمقبض لبدء سحب الكبد خارج التجويف البطني.

سوف يثبت الوريد الأجوف السفلي الكبد في مكانه. لذلك، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي مع الحرص على عدم تحرير الغدة الكظرية اليمنى قبل الأوان. افصل فصوص الكبد عن بعضها البعض عند نقاط الالتقاء واغمرها في مركب OCT وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

قم بتجميد مركب OCT الذي يحتوي على أنسجة الكبد في الشبكات المعدنية الموجودة في جهاز المقطاع بالتجميد (cryostat). وباستخدام جهاز المقطاع بالتجميد، قم بقطع مقاطع من العينة بسمك 5 µm عند درجة حرارة -18 °C، ثم ثبتها على شرائح مجهرية في درجة حرارة الغرفة. احفظ المخزون عند درجة حرارة -80 °C.

وأخيراً، يتم تحضير الشرائح لصبغة H&E وفقاً للإجراءات المذكورة سابقاً، واختبار ELISA وفقاً لبروتوكول النص. وكما يظهر في هذه المقاطع المصبوغة بـ H&E، أظهرت الفئران المعالجة بـ DT بنية كبدية غير منظمة وبدت عليها علامات الاحتقان مع زيادة في نشاط إنزيم AST في المصل. وفي غضون ستة أسابيع بعد الزرع، قامت الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية الكبدية البشرية بإعادة بناء بنية الكبد عن طريق استبدال الخلايا الكبدية المقيمة لدى الفئران.

من الناحية العيانية، تم رصد تجمعات كبدية بشرية صغيرة موزعة بشكل منتظم حول الكبد بعد أربعة أيام من عملية الزرع. وفي اليوم 45، تكاثرت هذه التجمعات لتتحول إلى تجمعات كبيرة. وكما يتضح هنا، تم تأكيد وجود الخلايا الكبدية البشرية في أكباد الفئران لأول مرة بعد ستة أسابيع من الزرع عن طريق الصبغ باستخدام أجسام مضادة للنوى البشرية والسايتوكيراتين 8/18.

شابهت الخلايا الكبدية البشرية التي كانت إيجابية لـ ALB وسلبية لـ CK19 الخلايا الكبدية الوظيفية، بينما أظهرت الخلايا التي صُبغت بشكل إيجابي مشترك لـ ALB و CK19 البشرية قدرة ثنائية الإمكانات على التمايز إلى خلايا كبدية وخلايا قناتية كبدية. وقد رُصد وجود تجمعات مستديرة متعددة تحيط بفصوص الكبد مع ظهور نوى بشرية واضحة وتعبير عن CK8/18، مما يثبت قدرة الخلايا الجذعية الكبدية البشرية على تكوين مستعمرات في الكبد المُبشر بخصائص بشرية. وأخيرًا، وصل مستوى إعادة التوطين إلى 90% بعد شهر واحد من الزرع، كما تم الكشف عن إفراز الألبومين البشري في أكباد الفئران التي تمت إعادة توطينها.

بمجرد إتقانها، يمكن إتمام عملية زرع الخلايا جراحياً في غضون 10 دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر وجوب قصر إصابة الكبد على الكبد المانح. ويجب منع زرع الخلايا في حالة حدوث تسرب خلوي.

بالاقتران مع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ترانسفكشن الجينات لإعادة البرمجة المباشرة في الجسم الحي باستخدام خلايا بشرية، وذلك لاستكشاف تقارب الخلايا البشرية مع نموذجنا الحالي. بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكبد لاستكشاف استقلاب الأدوية البشرية، والتفاعلات الدوائية-الدوائية، والسمية الكبدية، وفيروسات التهاب الكبد في نموذج كبد بشري. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتوسيع الخلايا الجذعية الكبدية، وتحفيز إصابة الكبد، وزراعة خلية عبر الطحال لإنشاء نموذج فأر خيمري يتمتع بوظائف كبد بشرية.

لا تنسَ أن سم الدفتيريا يمكن التحكم فيه وأنه يتطلب اتخاذ احتياطات هامة، مثل تجنب حدوث نخر في القلب والكبد، والتي يجب مراعاتها دائماً أثناء تنفيذ هذا الإجراء.