جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

الهدف العام من هذه الطريقة هو توليد أجنة الزرد البارابايتية ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الوظائف الجوهرية للخلية مقابل الوظائف الخارجية للخلية للجينات المرشحة ذات الأهمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول استقلالية الخلية. على سبيل المثال ، في نظام الدم ، تكون العيوب الحيوية في هجرة HSC متأصلة في HSCs أو البيئة المكروية المتخصصة.

الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي تحسين القدرة على توليد أجنة الزرد البارابايوتيك بنجاح. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأن الأجنة النامية هشة للغاية ، ويمكن إتلافها بسهولة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات الخياطة الجراحية لأنها تتطلب درجة عالية من الدقة والدقة.

نقدم هنا إرشادات خطوة بخطوة لتوليد أجنة أسماك الزرد البارابايوتيك عن طريق الاندماج الجراحي للأريمية النامية. توضح هذه الطريقة كيفية زيادة كفاءة الاندماج البارابايتيك وتعزيز بقاء الأجنة الملتصقة. بعد تحضير الكواشف والأدوات وفقا لبروتوكول النص، قم بإعداد ماصتين إلى ثلاث ماصات باستور معدلة عن طريق تسخين نهاية الماصة لفترة وجيزة فوق موقد بنسن.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط كبير ، بينما لا يزال ساخنا ، قم بثني نهاية الماصة حوالي 45 درجة. للتأكد من عدم وجود حواف حادة قد تلحق الضرر بالأجنة، احتفظ بنهاية الماصة فوق موقد بنسن لمدة ثانية إلى ثانيتين. باستخدام الحمض النووي للبلازما أو الحمض النووي الريبي المرسال أو المورفولينو ، قم بحقن الأجنة الدقيقة في غضون ساعة واحدة من التجميع ، والسماح لها بالتطور إلى مرحلة 256 خلية.

مع اقتراب الأجنة من مرحلة 256 خلية ، انقل كل خلفية وراثية إلى أطباق منفصلة مطلية بالأغاروز أو أكواب زجاجية خالية من الخدش أو أطباق بتري. بعد إزالة الأجنة وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة ميثيل السليلوز المحضر مسبقا ، واستخدم جهاز طرد مركزي منضدي بأقصى سرعة لحبيبات البلورات غير الذائبة ، مما يؤدي إلى إتلاف الأجنة أو تمزق الصفار. في غضون ذلك ، باستخدام علامة ، ضع علامة على 12 إلى 15 بقعة محددة مسبقا على الجانب السفلي من طبق بتري مغطى ب 100 ملليلتر من الأغاروز.

بعد ذلك ، بعد الطرد المركزي ، باستخدام الجزء العلوي الشفاف من ميثيل السليلوز ، قم بنقل قطرة واحدة إلى 1.5 سم إلى البقع المحددة في طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإعداد 40 ملليلتر من جرس عالي الكالسيوم ، أو محلول HCR لكل طبق مطلي بالأغروز تم إعداده للتو. إلى كل حصة ، أضف المضادات الحيوية كما هو موضح هنا.

عندما تكون جاهزا لإجراء اندماج الأريمة ، استخدم حصصات HCR مع المضادات الحيوية لملء كل طبق يحتوي على قطرات ميثيل السليلوز بعناية ، مع الحرص على عدم تعطيل القطرات. قم بتوصيل ماصة باستور زجاجية معدلة تم إعدادها مسبقا بمضخة ماصة سعة 10 مل. ثم ، تحت مجسم ، اجمع جنينا واحدا متفكثا من كل خلفية.

قبل توزيع الجنينين ، استخدم ماصة باستور لإحداث انخفاض صغير في منتصف قطرة ميثيل السليلوز. ثم قم بإيداع الجنينين في الاكتئاب. الآن ، باستخدام إبرة إغاظة مع طرف تحميل هلام في النهاية ، استخدم حركات كنس لطيفة دون لمس الأجنة مباشرة لإعادة وضع الأجنة بعناية داخل ميثيل السليلوز ، بحيث تلامس أقطاب حيواناتها بعضها البعض مباشرة.

إن توجيه الأجنة النامية بشكل صحيح يحدد كيفية اندماج الأجنة وتطورها. بالنسبة للاندماج وجها لوجه ، تأكد من محاذاة كل اندماج في أعمدة حيواناتهم. اسمح للأجنة بالجلوس لمدة خمس دقائق حتى يستقر ميثيل السليلوز حولها.

خلال هذا الوقت ، قم بتحميل الزوج التالي في قطرة أخرى. لإجراء الجراحة ، باستخدام أداة الإبرة الزجاجية ، جرح كل جنين بعناية عند نقطة ملامسته. ثم ، بحركة خياطة لطيفة ، اسحب الخلايا من الجنين الأول إلى الجنين الثاني والعودة مرة أخرى.

في نهاية الحركة ، أمسك الإبرة في مكانها لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان قبل سحبها بعيدا ببطء شديد. تعد الدقة في استخدام الإبرة الزجاجية أمرا بالغ الأهمية لضمان خياطة الأجنة معا بشكل صحيح. يجب توخي الحذر حتى لا تتلف أكياس الصفار مع الحفاظ على اتصال كاف للاندماج الناجح.

اسمح للأجنة بالجلوس لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك ، قم بغرزة أزواج إضافية من الأجنة. بعد الحضانة ، قم بتقييم ما إذا كانت الأجنة ظلت ملتصقة ، وكرر خطوة الجرح إذا لزم الأمر.

احتضان الأجنة في نفس الطبق ومتوسط عند 28.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بحلول صباح اليوم التالي ، ستكون الأجنة قد خرجت من ميثيل السليلوز المذاب في الغالب. قم بإزالة أي أجنة لم تندمج بنجاح.

ثم صب الوسط واستخدم 25 مل من E3 لاستبداله. للحصول على صور للأجنة المنصهرة ، قم بإعداد 0.8٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة. بينما لا تزال ساخنة ، قم بنقل 1 مليلتر من الاغاروز إلى أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر موضوعة في كتلة تسخين 37 درجة مئوية.

قم بتخدير الأجنة المجاورة للحيوية عن طريق إضافة مليلتر واحد من أربعة ملليغرام لكل مليلتر ، ودرجة الحموضة 7.0 تريكايين إلى 25 مل من وسط E3 الذي يحتوي على الأجنة. قم بتدوير الطبق برفق حتى تتجمع الأجنة في المنتصف. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل بلاستيكية عريضة الرأس ، اسحب الأجنة في أقل قدر ممكن من السائل.

بعد ذلك ، أدر الماصة في وضع مستقيم وقم بترتد الأجنة برفق حتى تستقر في قاع الماصة. بعد ذلك ، انقل الأجنة إلى 1 مليلتر من الاغاروز نقطة الانصهار المنخفضة عن طريق لمس طرف الماصة برفق على سطح الاغاروز. تخلص من أي سائل زائد من الماصة ، واستخدم الماصة لخلط الأجنة برفق في الاغاروز.

ثم ، باستخدام الماصة ، انقل الاغاروز والأجنة إلى بئر صفيحة زجاجية ذات ستة آبار. تحت المجهر المجسم ، استخدم طرف تحميل الجل المثبت على نهاية إبرة الإثارة لوضع الأجنة بالقرب من زجاج الغطاء وفي الاتجاه المطلوب للتصوير. بعد أن يتماسك الاغاروز ، وتمت إضافة وسط مع التريكين إلى الآبار ، استخدم مجهر مسح ضوئي بالليزر واسع النطاق مقلوب ، أو مجهر متحد البؤر للقرص الدوار للحصول على الصور.

بالنسبة لمجال رؤية الجنين الكامل ، استخدم هدف 4X. استخدم هدف 20X لتصوير نسيج معين. قم بمعالجة الصور وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح هنا ، بعد توجيه اثنين من الأرومة مع مواجهة أعمدة حيواناتها لبعضها البعض ، أصيبت الأجنة بجروح بعناية عند نقطة ملامستها. زادت درجة أكبر من الجرح من احتمالية احتفاظ الأجنة باتصال أدى إلى اندماج ناجح دون عيوب مورفولوجية إضافية أو تأخر النمو. كما هو موضح في هذا الشكل ، من خلال توجيه الأريمة مع محاذاة أقطاب حيواناتهما مباشرة ، تم إنشاء اندماجات موثوقة من كيس صفار البيض أو كيس صفار البيض مع الدورة الدموية المشتركة.

في معظم الحالات ، كان للأجنة قلبان يضخان الدورة الدموية المشتركة المشتركة. للتأكد من أن الأجنة تشترك بالفعل في الدورة الدموية ، تم دمج الأجنة المعدلة وراثيا المدمجة التي تحتوي على كريات الدم الحمراء الإيجابية ل GFP مع الأجنة التي تحتوي على خلايا بطانة وعائية إيجابية mCherry. كما رأينا في هذا الفيلم ، بعد 48 ساعة من الإخصاب ، لوحظت كريات الدم الحمراء الإيجابية ل GFP تنتشر عبر جنين شريك Flik 1 HRAS mChery.

أخيرا ، للتحقيق في التحكم الزمني في التعبير الجيني ، تم حقن أحد الجنينين ببنية الحمض النووي hsp70 EGFP. بعد صدمة حرارية قصيرة مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، تم إنشاء إشارة GFP واضحة في أحد الأجنة ، وفي بعض الحالات ، شوهدت خلايا إيجابية GFP تنتشر في جنين الشريك غير المحقون. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر عند خياطة الأريمة معا ، وإعادة النظر في عمليات الاندماج إذا لم تنجح الجراحة في المحاولة الأولى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق إضافية مثل تصوير الخلايا الحية للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كانت الخلايا الجذعية السرطانية من النوع البري يمكن أن تعمل بشكل طبيعي في مكانة متحولة أو على العكس من ذلك ، ما إذا كانت الخلايا الجذعية السرطانية الطافرة يمكن أن تعمل في مكانة من النوع البري. توفر هذه التقنية طريقة قوية للباحثين في مجال أمراض الدم لدراسة تنظيم نمو الدم في أسماك الزرد.

لا تنس أن tricaince يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء ملابس السلامة المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو واتباع التقنيات الموصى بها ، نأمل أن تتمكن من إنتاج أجنة أسماك الزرد الحيوية بشكل أفضل بنجاح أكبر.