فحص خلية مجاني عن طريق

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مستخلصات بيض وأجنة Xenopus لإنشاء مقايسة تتقلص فيها النوى الكبيرة لتصبح أصغر حجماً. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول بيولوجيا الخلية النووية، مثل ما هي الآليات التي تنظم حجم النواة؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن التحكم بسهولة في تكوين وأنشطة مستخلص Xenopus الخالي من الخلايا لتقييم العوامل المؤثرة على حجم النواة.

بعد تحضير مستخلصات بيض Xenopus، والحيوانات المنوية منزوعة الغشاء، والنوى المجمعة وفقاً للبروتوكول المكتوب، اجمع البيض الموضوع حديثاً عن طريق إمساك الضفادع فوق طبق بتري زجاجي قابل لإعادة الاستخدام. حفز عملية وضع البيض عن طريق تطبيق ضغط خفيف على أسفل الظهر بالقرب من المذرق. قم بإمالة الطبق بزاوية 45 درجة تقريباً للسماح بتجمع البيض على طول حافة الطبق.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم الزائد وأضف كمية كافية من محلول MMR بتركيز 1/3X لتغطية البيوض بالكاد. وباستخدام مدقة محكمة الإغلاق، قم بسحق وتجنيس 1/4 من خصية في أنبوب سعة 1.5 milliliter مع 500 microliters من محلول بارث الملحى المعدل (Modified Barth's Saline) عالي الملوحة، أو MBS. ثم أضف الخصية المسحوقة إلى البيوض واترك عملية الإخصاب تحدث في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 minutes.

بعد انتهاء فترة التحضين، اغمر البيوض بمحلول MMR بتركيز one-third X. بعد ذلك، وبعد مرور خمس إلى 10 دقائق، تحقق من حدوث الإخصاب من خلال ملاحظة انكماش القطب الحيواني داكن الصبغة، وعن طريق تدوير الأجنة بحيث تكون أقطابها الحيوانية متجهة للأعلى. وباستخدام ماصة بلاستيكية واسعة الفتحة، قم بإزالة البيوض الميتة، أو المتحللة، أو غير المخصبة، أو التي لم تنقسم بدقة، لأنها ستؤدي سريعاً إلى موت الأجنة المجاورة.

في أي وقت يتراوح من ساعة واحدة إلى 2.5 ساعة بعد الإخصاب، يتم إزالة الهلام من الأجنة باستخدام السيستين بتركيز يتراوح من 2% إلى 3% المذاب في محلول MMR بتركيز 1/3 X، والذي تم ضبط درجة حموضته عند pH 7.9. قبل عملية إزالة الهلام، تشغل الأجنة حجماً كبيراً نسبياً. قم بإجراء عمليتي تغيير للمحلول المنظم لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع دقائق لكل منهما.

بعد ذلك، اغسل الأجنة جيداً بستة إلى 10 تغييرات قصيرة من محلول one-third X MMR لإزالة جميع آثار السيستين. بعد عملية إزالة الهلام (dejellying)، تتكدس الأجنة بشكل وثيق وتشغل حجماً صغيراً نسبياً. تالياً، وباستخدام ماصة زجاجية واسعة الفتحة، انقل الأجنة المخصبة والسليمة إلى أطباق بتري تحتوي على محلول one-third X MMR طازج.

وفي درجة حرارة الغرفة، اترك الأجنة لتنمو حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة. استمر في إزالة الأجنة الميتة أو المتحللة، والتي يُستدل عليها بعدم حدوث الانقسام الأول أو بظهورها بمظهر أبيض ومنتفخ. وعندما تصل الأجنة إلى المرحلة 11.5 إلى 12، انقلها إلى محلول one-third X MMR طازج مضاف إليه 0.5 millimolar من cycloheximide، ثم حضّن الأجنة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لإيقاف نموها في طور البينطوار المتأخر.

باستخدام ماصة زجاجية أو بلاستيكية واسعة الفتحة، انقل ما لا يقل عن 15 جنينًا متوقفة في الطور البيني إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف ملليلتر واحد من محلول تحلل البويضات، أو ELB، مضافًا إليه ميكرولتر واحد من مخزون LPC إلى الأجنة. اقلب الأنبوب برفق لغسل الأجنة.

بعد ذلك، اترك الأجنة تترسب في قاع الأنبوب. وقبل إزالة المحلول المنظم، كرر عملية الغسيل مرتين إضافيتين. أعد تعليق الأجنة في 500 µL من ELB، بالإضافة إلى 0.5 µL من مخزون LPC، و 5 µL من 19.7 mM من cycloheximide، و 5 µL من 35.5 mM من cytochalasin D لتثبيط بلمرة الأكتين.

قم بطرد العينات مركزياً في جهاز طرد مركزي مكتبي عند 200 ×g لمدة دقيقة واحدة، ثم تخلص من المحلول المنظم الزائد واستخدم مدقة لسحق الأجنة جيداً. ضع العينات المسحوقة في دوار ذي دلاء متأرجحة وقم بطردها مركزياً عند 10,000 ×g ودرجة حرارة 16 °C لمدة 10 دقائق. وباستخدام رأس ماصة سعة 200 µL، قم بثقب الطبقة الدهنية من الأعلى، ثم استخدم رأس ماصة نظيفاً لنقل الطبقة السيتوبلازمية الوسطى ذات اللون الكهرماني إلى أنبوب بحجم مناسب.

قم بتدعيم مستخلص الجنين بالكواشف التالية. بعد ذلك، اقلب الأنبوب برفق للمزج. ثم، بعد معاينة النوى الجنينية الداخلية في المستخلص عن طريق تحضير مسحة وفقًا لبروتوكول النص، قم بإزالة النوى من المستخلص عن طريق إضافة حجم مساوٍ من ELB الذي يحتوي على الكواشف المدرجة هنا أولاً.

اقلب الأنبوب برفق للمزج. قم بطرد العينة مركزياً باستخدام دوار ذو دلاء متأرجحة عند 17,000 ×g وبدرجة حرارة 16 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، اجمع السائل الطافي، مع الحرص على تجنب أي دهون متبقية في الأعلى، واترك النوى المترسبة في القاع دون تحريك.

قم بإعداد تحضير السحق (squash) كما هو موضح في البروتوكول النصي للتأكد من إزالة معظم النوى. بعد ذلك، استخدم المستخلص الطازج، أو قم بتقسيم العينة إلى حصص وتخزينها عند درجة حرارة -80 °C. اعزل النوى المتجمعة في مستخلص البيض عن طريق تخفيف 25 إلى 150 µL من النوى المجمعة مسبقاً في 1 mL من محلول ELB في أنبوب سعة 1.5 mL.

قم بالطرد المركزي عند 1600 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم، مع الحرص على عدم تعكير الراسب. أضف إلى الراسب حجماً من مستخلص الجنين مساوياً للحجم الأصلي لمستخلص البيضة، ثم انقر برفق على الأنبوب لتفتيت الراسب وإعادة تعليق النوى.

يُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة، مع النقر بلطف على الأنبوب للمزج كل 15 إلى 30 دقيقة. بعد فترة التحضين، يُنقر على الأنبوب لإعادة تعليق النوى مباشرة قبل إضافة 500 µL من محلول ELB المحتوي على 15% glycerol و 2.6% Paraformaldehyde. يُقلب الأنبوب فوراً، ثم يُوضع على جهاز تدوير (rotator) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

قم بتجهيز أنابيب الطرد المركزي عن طريق تزويد أنابيب زجاجية مستديرة القاع سعة 15 milliliter بقطع بلاستيكية داخلية مستديرة القاع. أضف 5 milliliters من محلول وسادة النواة المنظم (nuclear cushion buffer)، ثم ضع غطاء شريحة دائري بقطر 12 millimeter داخل الأنبوب، مع التأكد من استقراره بشكل مسطح فوق القطعة البلاستيكية الداخلية. باستخدام رأس ماصة واسع الفتحة، قم بإضافة محلول النوى المثبتة بلطف كطبقة فوق وسادة النواة.

قم بطردها مركزياً باستخدام دوار ذي دلاء متأرجحة عند 1,000 ×g ودرجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، استخدم جهاز شفط لإزالة كل المحلول المنظم مع تثبيت القطعة البلاستيكية الداخلية عند الجزء العلوي من الأنبوب. ثم، وباستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة غطاء الشريحة، مع الحرص على ملاحظة الجانب الذي استقرت عليه النوى من غطاء الشريحة.

يتم تثبيت غطاء الشريحة في ميثانول بارد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يُنقل غطاء الشريحة، بحيث يكون جانب النوى للأعلى، فوق ورقة من فيلم البارافين البلاستيكي المبطن لطبق بتري بلاستيكي كبير. ثم توضع مناديل مبللة مخصصة للاستخدام مرة واحدة على طول جانب الطبق لمنع الجفاف.

باستخدام 500 µL من PBS NP40، أعد ترطيب النوى على شريحة التغطية لمدة تتراوح من خمس إلى 10 ثوانٍ ثم قم بسحب السائل. بعد ذلك، أضف بعناية 75 µL من PBS 3%BSA على شريحة التغطية، واتركها لعملية الحجب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. قم بإزالة محلول الحجب ثم ابدأ الحضانة باستخدام الجسم المضاد الأولي المخفف في PBS 3%BSA.

بعد ذلك، تُغسل العينات بخمس تغييرات متتالية من PBS NP40. تُكرر خطوات الحضن والغسل هذه باستخدام الأجسام المضادة الثانوية. تُحضن العينات مع 10 micrograms per milliliter من Hoechst المخفف في PBS 3%BSA لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل خمس مرات باستخدام PBS NP40 وأزل كل فائض من المحلول المنظم. وأخيراً، قم بتثبيت غطاء الشريحة على شريحة باستخدام 5 µL من وسط تثبيت مضاد للتلاشي. استخدم طلاء أظافر شفافاً لإحكام غلق غطاء الشريحة وقم بالتصوير فوراً باستخدام مجهر الفلورسنت فوق البؤري أو احفظها في درجة حرارة 40 °C للتصوير لاحقاً.

يوضح هذا الشكل عملية تجميع نوى مستخلص البيض. بعد مرور 30-45 دقيقة من بدء التفاعل، يجب أن تبدأ نوى الحيوانات المنوية الرقيقة ذات الشكل S في التسمك لتتحول إلى كتل كروماتينية تشبه البزاقة. وبعد حدوث التجميع النووي، يجب أن يصبح شكل النواة أكثر استدارة، كما يجب أن يزداد الحجم النووي مع تمدد الغلاف النووي واستيراد البروتينات النووية.

كما هو موضح هنا، يُظهر تحضير هرسي (squash) لكمية صغيرة من مستخلص الجنين المصبوغ بصبغة Hoechst العديد من النوى المصبوغة، مما يشير إلى نجاح عملية تحضير المستخلص. وبعد إزالة النوى عن طريق الطرد المركزي، وبالمقارنة مع التحضير الهرسي الأول، يجب أن يتبقى عدد قليل جداً من النوى في المستخلص، كما هو موضح في هذه اللوحة، مما يضمن عدم تداخل النوى الداخلية مع التحليلات اللاحقة. وإذا كانت النوى لا تزال موجودة، فإن الأمر يتطلب جولة ثانية من الطرد المركزي.

في هذا المقايسة لتقلص النواة، تتقلص أنوية مستخلص البيض المعاد تعليقها في مستخلص أجنة في مرحلة متأخرة بنجاح بمرور الوقت. ومع ذلك، فإن الأنوية التي تم تحضينها مع مستخلص أجنة تم تثبيطه حرارياً لا تتقلص. ويعد تكرار التجربة عدة مرات أمراً هاماً لمعالجة التباين المتأصل في هذه المقايسة.

بمجرد إتقان البروتوكول، يمكن تنفيذ العملية بأكملها في يومين، حيث يستغرق اختبار انكماش النواة نفسه حوالي أربع ساعات. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء فحص الجودة للبويضات والأجنة طوال الوقت، وتوخي الحذر الشديد لتجنب الرواسب وطبقات الدهون عند جمع المستخلص السيتوبلازمي بعد عملية الطرد المركزي. كما يجب التحقق من صحة النتائج التي يتم الحصول عليها من خلال اتباع هذا الإجراء.

على سبيل المثال، الحقن المجهري للأجنة، أو عفن الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لاستكشاف تنظيم حجم العضيات الأخرى. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية النووية لاستكشاف الآليات التنظيمية لحجم النواة والدور الوظيفي لحجم النواة في التطور والسرطنة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع وعزل نوى مستخلص بيض Xenopus، وتوليد أجنة Xenopus ومستخلص الأجنة، وإجراء مقايسة انكماش النواة وتصوير النتائج.