جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

تولد خلايا نخاع العظام المزروعة بعامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحبب (GM-CSF) مزرعة غير متجانسة تحتوي على الضامة والخلايا المتغصنة (DCs). تسلط هذه الطريقة الضوء على استخدام ارتباط MHCII و hyaluronan (HA) للتمييز بين البلاعم عن DCs في ثقافة GM-CSF. البلاعم في هذه الثقافة لها العديد من أوجه التشابه مع البلاعم السنخية.

الهدف العام هو أن هذا الإجراء هو توليد وتمييز البلاعم الشبيهة بالسنخية عن الخلايا المتغصنة في مزارع خلايا نخاع عظم الفئران في المختبر المكملة ب GM-CSF. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في المختبر في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظيفة الخلايا المتغصنة أو الضامة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تولد أعدادا كافية من الخلايا ويمكنها التمييز بين الخلايا المتغصنة والضامة الشبيهة بالسنخية.

قد تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج البروتينات الرئوية لأنها تسهل اكتساب البلاعم الشبيهة بالسنخية ، والتي يمكن استخدامها لعلاج هذا المرض. بشكل عام ، سيحتاج الأفراد الجدد في هذه الطريقة إلى ممارسة عزل العظام النظيفة وتنظيف نخاع العظام. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا حيث لا يمكن فهم جميع التقنيات المستخدمة بسهولة من خلال التعليمات المكتوبة وحدها.

قبل 15 دقيقة من بدء التشريح ، قم بتشغيل خزانة السلامة البيولوجية لتطهير هواء الخزانة ، وتثبيت تدفق الهواء ، وتنظيف سطح الخزانة بنسبة 70٪ من الإيثانول. عندما تكون الخزانة جاهزة ، ضع فأرة فوق منشفة ورقية أو منشفتين في وضع الانبطاح ورش بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ، باليد غير المهيمنة ، ارفع الجلد حول منطقة الصدر واستخدم المقص لعمل شق.

أمسك طرفي الشق ، اسحبه بحذر حتى يلتقي طرفي الشق عند المعدة. ثم ضع الماوس في وضع ضعيف واستخدم إحدى يديك لسحب النصف السفلي من الجلد لأسفل حتى تنكشف الساقين. أمسك القدم ، وقطع أوتار العرقوب فوق مفصل الكاحل والأربطة التي تربط العضلات بالقدم في الطرف السفلي من الساق لتخفيف القدم من عظام الساق.

حافظ على رفع الساق ، قم بإزالة العضلات والأربطة حول مفصل الركبة في الطرف السفلي من عظم الفخذ لتشديد عضلات الفخذ من أسفل الساق. باستخدام الملقط ، اسحب العضلات المرتخية برفق بعيدا عن الأسطح الشظوية والفخذية. ثم اضغط على المقص في الوضع المفتوح عند مفصل الورك ، وقم بتدوير الساق واسحب عظم الفخذ برفق لفصل عظم الفخذ عن مفصل الورك أثناء قطع الساق من الجسم.

الآن تمسك الساق في نهاية الورك بملقط معقم ، واستخدم ملقطا آخر لإزالة القدم من نهاية الكاحل. ثم أمسك الطرف البعيد لعظم الفخذ بملقط واحد والطرف القريب من الظنبوب والشظية بآخر ، وثني الساق والشظية بعناية في الاتجاه المعاكس لمفصل الركبة لفصل أسفل الساق عن عظم الفخذ والرضفة. استخدم الملقط لإزالة الأربطة والعضلات والشظية المتبقية من عظام أسفل الساق ووضع الساق النظيفة على غطاء طبق بتري مقلوب ، يحتوي على واحد إلى ملليلترين من HBSS / FCS.

أمسك الطرف السفلي من عظم الفخذ بمجموعة من الملقط والرضفة بأخرى ، ثني الركبة والأنسجة المحيطة بها في الاتجاه المعاكس لإزالة المفصل. ثم قم بإزالة أي من الأنسجة الضامة المتبقية من عظم الفخذ وضع العظم على غطاء طبق بتري المقلوب. عندما يتم حصاد جميع العظام ، استخدم الملقط لتنظيف أي أنسجة متبقية لا تزال ملتصقة بالعظام واغمر العظام في 10 مل من HBSS / FCS داخل قاعدة طبق بتري.

الحفاظ على الطبق محميا جزئيا بغطاء معقم ، وقطع كل من العظام النظيفة إلى نصفين بالمقص. ثم استخدم حقنة سعة مليلتر واحد ، مزودة بإبرة قياس 26.5 لطرد مليلتر واحد من HBSS / FCS من الطبق إلى نهاية كل قطعة عظمية حتى يتم تحرير كل النخاع الأحمر. مرر أي كتل مرئية من نخاع العظم عبر المحقنة عدة مرات لتشكيل معلق خلية واحدة، متبوعا بخلط شامل بماصة سعة 10 ملليلتر.

انقل الخلايا إلى أنبوب تجميع واشطف طبق بتري مرة واحدة بخمسة ملليلتر من HBSS / FCS لجمع أي خلايا متبقية. ثم قم بتجميع الغسيل في أنبوب التجميع وضع الخلايا على الثلج. لإعداد مزرعة خلايا نخاع العظم ، قم بالطرد المركزي للخلايا المجمعة وشفط المادة الطافية باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة متصلة بالشفط الفراغي.

بفك الحبيبات الغنية بخلايا الدم الحمراء مع النقر. ثم أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء وأعد تعليق الخلايا بالدوامة. بعد خمس دقائق ، حضانة بدرجة حرارة الغرفة ، قم بإيقاف التحلل باستخدام 10 ملليلتر من HBSS / FCS وقم بتدوير الخلايا ، وإعادة تعليق الحبيبات في وسط خلية نخاع العظم.

احسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد Trypan Blue وانقل الخلايا المطلوبة إلى أنبوب جديد بوسط خلية نخاع العظم. ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات عند أربعة ملايين خلية لكل مليلتر تخفيف في وسط خلية نخاع العظم مع 20 نانوغرام لكل مليلتر من GM-CSF. بعد ذلك ، أضف 9.5 مل من وسط خلايا نخاع العظم المكملة ب 20 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى طبق بتري بكتيري معقم لكل ثقافة وأضف 500 ميكرولتر من الخلايا إلى وسط كل طبق.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث ، أضف 10 ملليلتر من وسط نخاع العظم الطازج المكمل ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من GM-CSF إلى كل مزرعة ، مع الحرص على تقليل أي اضطرابات للخلايا. في اليوم السادس ، انقل بعناية 10 مل من المادة الطافية لزراعة الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.

الطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط خلية نخاع العظم الطازج ، تحتوي على 20 نانوغرام لكل مليلتر من GM-CSF. ثم قم بدوامة تعليق الخلية برفق وأعد الخلايا إلى طبق الثقافة. في اليوم الأول ، تكون خلايا نخاع العظم صغيرة ومتناثرة ولكن بحلول اليوم الثالث ، زادت الخلايا من حيث العدد والحجم ، وبدأ بعضها في الالتصاق.

بحلول اليوم السادس ، هناك المزيد من الخلايا ولوحظت كل من الكسور الملتصقة وغير الملتصقة. يمكن حصاد المزرعة من اليوم السابع إلى العاشر وتسيئتها حسب الحجم والخلايا الحية بنسبة أعلى من الخلايا الإيجابية ل CD11c التي تم الحصول عليها من ثقافات اليوم 10. في اليوم السابع ، يتم إثراء الجزء غير الملتصق الذي تم جمعه بشكل كبير للخلايا ذات التشكل الشجيري.

يمكن تقسيم المجموعات الإيجابية ل CD11c ، والسلبية GR1 ، التي تم حصادها في اليومين السابع و 10 ، إلى ثلاثة مجموعات رئيسية. الضامة والخلايا المتغصنة غير الناضجة والخلايا المتغصنة الناضجة عن طريق تعبير MHCII وربط FL-HA. ومن المثير للاهتمام ، أن MerTK ، على الرغم من اعتباره علامة بلاعم ، إلا أنه يظهر تعبيرا قويا عن كل من مجموعات الخلايا المتغصنة والبلاعم غير الناضجة ، التي تم حصادها في اليومين السابع و 10 ، مع انخفاض مستوى التعبير الذي لوحظ على الخلايا المتغصنة الناضجة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام تقنيات معقمة طوال فترة حصاد نخاع العظم وزراعة الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا فرز الخلايا لفحص مجموعات الخلايا بشكل منفصل ، أو يمكن تحفيزها بعوامل التهابية وتحليلها لاحقا لإنتاج السيتوكين عن طريق التلوين داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا نخاع العظم وزراعتها في GM-CSF لتوليد كل من الخلايا المتغصنة والضامة الشبيهة بالسنخية.