جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد وتمييز البلاعم الشبيهة السنخية عن الخلايا التغصنية في مستنبتات خلايا نخاع العظم الفأرية المختبرية المدعومة بـ GM-CSF. يمكن لهذه الطريقة المختبرية أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بوظيفة الخلايا التغصنية أو البلاعم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على توليد أعداد كافية من الخلايا وإمكانية التمييز بين الخلايا التغصنية والبلاعم الشبيهة السنخية.

قد تمتد آثار هذه التقنية لتشمل علاج البروتينوسيس الرئوي، حيث أنها تسهل الحصول على بلعميات شبيهة بالسنخية، والتي يمكن استخدامها لعلاج هذا المرض. وبوجه عام، سيحتاج الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة إلى التدريب على عزل العظام المنظفة وغسل نخاع العظم. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً، لأن ليس كل التقنيات المستخدمة يمكن فهمها بسهولة من خلال التعليمات المكتوبة وحدها.

قبل البدء في عملية التشريح بـ 15 دقيقة، قم بتشغيل كابينة السلامة البيولوجية لتطهير الهواء داخلها وتثبيت تدفقه، ونظف سطح الكابينة باستخدام 70% ethanol. وعندما تصبح الكابينة جاهزة، ضع الفأر في وضعية الانبطاح فوق منديلاً أو منديلين ورقيين ورش الحيوان بـ 70% ethanol. بعد ذلك، وبالاستعانة باليد غير المهيمنة، ارفع الجلد حول المنطقة الصدرية واستخدم المقص لإجراء شق جراحي.

أمسك كلا طرفي الشق، واسحبهما بعناية حتى يلتقي الطرفان عند المعدة. ثم ضع الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر واستخدم إحدى يديك لسحب النصف السفلي من الجلد للأسفل حتى تظهر الأرجل. مع تثبيت القدم، اقطع أوتار أكيليس فوق مفصل الكاحل والأربطة التي تربط العضلات بالقدم عند الطرف السفلي لعظمة الظنبوب لتحرير القدم من عظام الساق.

مع إبقاء الساق مرفوعة، قم بإزالة العضلات والأربطة المحيطة بمفصل الركبة عند الطرف السفلي لعظمة الفخذ لفصل عضلات الفخذ عن الساق السفلية. وباستخدام الملاقط، اسحب العضلات التي تم إرخاؤها برفق بعيداً عن سطحي عظمتا الشظية والفخذ. بعد ذلك، ومن خلال ضغط المقص في وضعية الفتح عند مفصل الورك، قم بتدوير الساق واسحب عظمة الفخذ برفق لفصل عظمة الساق عن مفصل الورك أثناء قطع الساق لتحريرها من الجسم.

أمسك الساق من طرف الورك باستخدام ملقط معقم، واستخدم ملقطاً آخر لإزالة القدم من طرف الكاحل. ثم أمسك الطرف القاصي لعظمة الفخذ بملقط والطرف الداني لعظمتي الظنبوب والشظية بملقط آخر، وقم بثني الظنبوب والشظية بعناية في الاتجاه المعاكس لمفصل الركبة لفصل الساق السفلية عن الفخذ والرضفة. استخدم الملقط لإزالة الأربطة والعضلات والشظية المتبقية من عظام الساق السفلية، وضع الظنبوب بعد تنظيفه على غطاء طبق بتري مقلوب، يحتوي على 1 إلى 2 milliliters من HBSS/FCS.

أمسك الطرف السفلي من عظمة الفخذ بمجموعة واحدة من الملاقط والرضفة بمجموعة أخرى، ثم اثنِ الركبة والأنسجة المحيطة في الاتجاه المعاكس لإزالة المفصل. بعد ذلك، قم بإزالة أي من الأنسجة الضامة المتبقية من عظمة الفخذ وضع العظمة على غطاء طبق بتري المقلوب. وعند الانتهاء من استخلاص جميع العظام، استخدم الملاقط لتنظيف أي أنسجة متبقية لا تزال ملتصقة بالعظام، ثم اغمر العظام في 10 milliliters من HBSS/FCS داخل قاعدة طبق بتري.

مع إبقاء الطبق محمياً جزئياً بغطاء معقم، قم بقص كل عظمة من العظام التي تم تنظيفها إلى نصفين باستخدام المقص. ثم استخدم حقنة سعة 1 مل، مجهزة بإبرة مقاس 26.5، لضخ 1 مل من محلول HBSS/FCS من الطبق إلى نهاية كل قطعة عظم حتى يتم تحرير كل النخاع الأحمر. مرر أي تكتلات مرئية من نخاع العظام عبر الحقنة عدة مرات لتكوين معلق من الخلايا المفردة، ثم اتبع ذلك بالخلط الجيد باستخدام ماصة سعة 10 مل.

انقل الخلايا إلى أنبوب تجميع واغسل طبق بيتري مرة واحدة باستخدام 5 mL من HBSS/FCS لجمع أي خلايا متبقية. بعد ذلك، اجمع سائل الغسيل في أنبوب التجميع وضع الخلايا على الثلج. ولتجهيز مزرعة خلايا نخاع العظم، قم بطرد الخلايا المجمعة مركزياً واسحب السائل الطافي باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة متصلة بجهاز شفط تفريغي.

قم بتفكيك الراسب الغني بخلايا الدم الحمراء عن طريق النقر. ثم أضف 10 milliliters من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC lysis buffer) وأعد تعليق الخلايا باستخدام جهاز الـ vortex. بعد التحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، أوقف عملية التحلل بإضافة 10 milliliters من HBSS/FCS وقم بطرد الخلايا مركزياً، ثم أعد تعليق الراسب في وسط زراعة خلايا نخاع العظم.

قم بتعيين عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan Blue وانقل الخلايا المطلوبة إلى أنبوب جديد يحتوي على وسط زراعة خلايا نخاع العظم. بعد ذلك، قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب بتركيز 4 million cells/mL في وسط زراعة خلايا نخاع العظم المضاف إليه 20 ng/mL من GM-CSF. تلى ذلك إضافة 9.5 mL من وسط زراعة خلايا نخاع العظم المدعم بـ 20 ng/mL من GM-CSF إلى طبق بتري بكتيري معقم واحد لكل مستنبت، ثم أضف 500 µL من الخلايا في مركز كل طبق.

يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% CO2. وفي اليوم الثالث، يُضاف 10 milliliters من وسط نخاع العظم الطازج المكمل بـ 20 nanograms per milliliter من GM-CSF إلى كل مزرعة، مع الحرص على تقليل أي اضطرابات قد تتعرض لها الخلايا. وفي اليوم السادس، يتم نقل 10 milliliters من طافي مزرعة الخلايا بعناية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 milliliter.

قم بطرد الخلايا مركزياً ثم أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط خلايا نخاع العظم الطازج، الذي يحتوي على 20 nanograms per milliliter من GM-CSF. بعد ذلك، قم برج تعليق الخلايا برفق باستخدام جهاز الفورتيكس وأعد الخلايا إلى طبق الزرع. في اليوم الأول، تكون خلايا نخاع العظم صغيرة ومتفرقة، ولكن بحلول اليوم الثالث، تزداد الخلايا في العدد والحجم، ويبدأ بعضها في الالتصاق.

بحلول اليوم السادس، يزداد عدد الخلايا ويُلاحظ وجود كسور ملتصقة وغير ملتصقة. يمكن حصاد المزرعة من اليوم السابع إلى العاشر، ويتم فرزها بناءً على الحجم والخلايا الحية، مع الحصول على نسبة أعلى من الخلايا الموجبة لـ CD11c من مزارع اليوم العاشر. وفي اليوم السابع، يكون الكسر غير الملتصق الذي تم جمعه غنياً للغاية بالخلايا ذات المورفولوجيا التغصنية.

يمكن تقسيم المجموعات الخلوية الموجبة لـ CD11c والسالبة لـ GR1، والتي تم جمعها في اليومين السابع والعاشر، إلى ثلاث مجموعات رئيسية: البلاعم، والخلايا التغصنية غير الناضجة، والخلايا التغصنية الناضجة، وذلك بناءً على تعبير MHCII وارتباط FL-HA. ومن المثير للاهتمام أن MerTK، رغم اعتباره علامة مميزة للبلاعم، يظهر تعبيراً قوياً في كل من مجموعات البلاعم والخلايا التغصنية غير الناضجة التي جُمعت في اليومين السابع والعاشر، مع ملاحظة مستوى تعبير منخفض في الخلايا التغصنية الناضجة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام التقنيات المعقمة طوال عملية حصاد نخاع العظم وزراعة الخلايا. وبعد هذا الإجراء، يمكن أيضاً فرز الخلايا لفحص المجموعات الخلوية بشكل منفصل، أو يمكن تحفيزها بعوامل التهابية ثم تحليل إنتاجها من السيتوكينات عن طريق الصبغ داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا نخاع العظم وزراعتها في GM-CSF لتوليد كل من الخلايا التغصنية والبلاعم الشبيهة بالسنخية.