مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع غلاف مركب متعدد الكهارل. ناقل يمكنه حبس وتنظيم إطلاق مجموعة واسعة من عوامل النمو مع مجال ربط الهيبارين. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة أنسجة العظام من أجل فخ فعال وتخصيص عوامل النمو.

المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام المواد العضوية في كثير من الأحيان. والذي من المعروف أنه يؤثر على الأنشطة الحيوية لعوامل النمو. قم بإذابة 200 ملليغرام من ألجينات الصوديوم غير المشعة أو 400 ملليغرام من ألجينات الصوديوم المشعة بثمانية ميجاراد في 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.

ورجها لمدة ساعة. قم بتخزين محلول الجينات على حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. قم بتصفية محلول الجينات باستخدام مرشح حقنة معقم 0.2 ميكرون قبل تصنيع دقيق الجينات.

قم بتطهير مولد BE الكهروستاتيكي ومضخة الحقنة بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضعهما في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. ثم ضع حوضا زجاجيا بقضيب تحريك مغناطيسي داخل مولد BE. اضبط قطب ذراع مولد BE على ارتفاع تسعة سنتيمترات فوق الحوض.

قم بتوصيل كابل القطب الكهربائي لمولد BE بالمسمار العصبي اثنين من قطب الذراع. وصب 80 مل من محلول كلوريد السترونتيوم في الحوض. بعد ذلك ، قم بتحميل خمسة ملليلتر من محلول الجينات المفلتر 0.2 ميكرون في المحقنة في أنبوب مطاطي.

بعد توصيل الأنبوب المطاطي بقطب الذراع ، قم بتشغيل مضخة المحقنة بمعدل خمسة ملليلتر في الساعة. لمدة دقيقتين. لطرد الهواء داخل الأنبوب وتوصيل محلول الجينات إلى طرف الفوهة.

ثم قم بإيقاف تشغيل مضخة المحقنة. لبدء توليد الميكروبياد ، اضبط المغلف على 5.8 كيلو فولت. تليها مضخة الحقنة بمعدل تدفق ألجينات يبلغ خمسة ملليلتر في الساعة.

تخلص من الميكروبيدات التي تم إنشاؤها خلال الدقيقتين الأوليين لأن هذه الميكروبيدات تميل إلى أن تكون غير منتظمة الحجم والشكل. اجمع الميكروبيدات اللاحقة في محلول كلوريد السترونتيوم 0.2 مولار. قم بإيقاف تشغيل مضخة الحقنة متبوعة بالغلاف.

بعد ضخ الحجم المخطط مسبقا لمحلول الجينات. كرر هذا للدفعات اللاحقة من تصنيع الميكروبيد. قم بتخزين الميكروبيدات في 20 مل من محلول كلوريد السترونتيوم 0.2 مولار عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لإكمال الربط المتقاطع وتثبيت الجل.

اجمع 0.5 مل من ميكروبيدات الجينات باستخدام ماصة بلاستيكية. ووضعه على شريحة زجاجية. عرض الميكروبيدات تحت المجهر البصري بتكبير 10x.

التقط 10 صور للميكروبيدات باستخدام كاميرا CCD مجهرية. احفظ الصور بشريط مقياس 500 ميكرون بتنسيق TIFF بدقة 2048 × 1536. باستخدام أدوات الطول في الصورة J ، قم بقياس حجم الميكروبيدات.

وشريط المقياس. ثم قم بتحويل طول الميكروبيد من البكسل إلى الميكرومتر. انقر فوق أدوات الخط وارسم خطا عبر منتصف حبة الجينات.

انقر فوق تحليل في شريط القائمة وحدد قياس. ستظهر نافذة منبثقة. كرر هذه الخطوات لقياس جميع حبات الجينات داخل الصورة.

قم بقياس شريط المقياس على الصورة. اجمع الميكروبيدات باستخدام مصفاة النايلون 100 ميكرون. واغسل الخرز بالماء المقطر المزدوج.

باستخدام ملعقة ، انقل جميع الميكروبيدات المصنوعة من 0.1 مل من محلول الجينات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين وقم بتغطيته بشاش لمنع الجفاف. أخيرا ، قم بتعقيم الميكروبيدات عن طريق الشق التلقائي باستخدام الوضع السائل أو وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. أضف 1.5 لتر من الماء المقطر إلى الغرفة لمنع الخرز من الجفاف.

داخل غطاء محرك BSL2 ، احتضن الميكروبيدات المعقمة بملليلتر واحد من محلول البروتامين المعقم ملليغرامين لكل مليلتر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الميكروبيدات المطلية بالبروتامين مرتين بالماء المقطر المزدوج. ثم قم بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الماء باستخدام حقنة. احتضان الميكروبيدات المغلفة بالبروتامين بملليلتر واحد من محلول الهيبارين المعقم 0.5 ملليغرام لكل مليلتر لمدة 30 دقيقة. هذا يخلق غلاف مركب متعدد الإلكتروليت مع تقارب شديد لعوامل نمو ربط الهيبارين.

بعد الحضانة ، قم بشفط الكبد باستخدام حقنة. واغسل الهيبارين غير المرتبط من مجمعات البولي إلكتروليت عن طريق غسله مرتين بالماء المقطر المزدوج. قم بتحميل 13.3 ميكرولتر من 1.5 ملليغرام لكل مليلتر من البروتين المورفوجيني للعظام 2 أو محلول الجزيء 1 الشبيه ب NELL على 100 ميكروغرام من مركب البولي إلكتروليت.

احتضان مركب البولي إلكتروليت عند أربع درجات مئوية تحت 30 دورة في الدقيقة ، مع رجها لمدة 10 ساعات. بعد ذلك ، اغمر الميكروبيدات في مليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر. اجمع ملليلترا واحدا من المادة الطافية واستبدلها ملليلتر واحد من PBS بعد يوم وثلاثة وستة و10 و 14 يوما.

قم بتقييم كفاءة امتصاص وإطلاق NELL مثل الجزيء الأول باستخدام طريقة فحص البروتين CBQCA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بدلا من ذلك ، قم بإجراء elisa. يتم تقييم النشاط الحيوي ل NELL مثل الجزيء الذي يتم إطلاقه من مركب البولي إلكتروليت عن طريق قياس قدرته على زيادة التعبير عن الفوسفاتيز القلوي في الخلايا الجذعية لنخاع عظم الأرانب.

بذرة 20،000 خلايا جذعية لنخاع عظم الأرانب لكل بئر في صفيحة 24 بئر. واسمح لهم بالنمو ليوم واحد باستخدام مليلتر واحد من وسط النسر المعدل من dulbecco بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري للجنين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط بمليلتر واحد من وسط العظم لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية.

و 5٪ CO2. ضع 300 ميكروغرام من مركب البولي إلكتروليت ومركب البولي إلكتروليت NELL مثل الجزيء داخل إدراج ثقافة الخلية للحفاظ على المجمعات منفصلة عن الخلايا. ضع الملحق في لوحة 24 بئر لتجنب غسل الميكروبيدات المعقدة متعددة الإلكتروليت أثناء تغيير وسط العظم.

مرة كل ثلاثة أيام ، استنشق ملليلتر واحد من وسط العظم عن طريق وضع إبرة خارج الملحق واستبدلها بملليلتر واحد من وسط العظم الطازج. بعد سبعة و 14 يوما من الحضانة ، حدد نشاط الفوسفاتيز القلوي باستخدام مجموعة فحص الفوسفاتيز القلوي.

وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة. قم بتعبئة مجمعات البولي إلكتروليت في مسام سقالة فوسفات الكالسيوم ثلاثي البوليكابرولاكتون الطبية القابلة للامتصاص الحيوي. باستخدام ملعقة معقمة داخل غرفة BSL2.

أضف محلول 1.5 ملليغرام أو مليلتر من البروتين المورفوجيني للعظام اثنين أو جزيء NELL مثل الجزيء واحد على السقالة المليئة بمركب البولي إلكتروليت. واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. يتم فحص ميكروبيدات الجينات تحت المجهر لمراقبة حجمها وتشكلها.

ميكروبيدات الجينات غير المشعة كروية والنظير المشع على شكل دمعة. يعد توزيع الحجم عاملا مهما لامتصاص عامل النمو. وتقليل الحجم يزيد من نسبة السطح إلى المساحة.

عند قياس ميكروبيدات الجينات باستخدام برنامج الصورة J ، يوفر متوسط 100 ميكروبيد تقديرا جيدا لتوزيع الحجم في كل تطابق من الميكروبيدات. نظرا لأن امتصاص عامل النمو يعتمد على تقنية الطلاء المناسبة ، يتم ملاحظة سمك الطبقة لكل طلاء بواسطة ميكروسوبي متحد البؤر. هنا ، يتم عرض صور المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر لميكروبيدات الجينات المحتضنة بنظائر فلورية من البروتامين والهيبارين و NELL مثل الجزيء الأول والبروتين المورفوجيني للعظام الثانية.

يستخدم نشاط الفوسفاتيز القلوي لقياس النشاط الحيوي لعامل النمو الذي تم إطلاقه. لوحظت زيادة بمقدار 2.2 ضعفا في نشاط الفوسفاتيز القلوي بعد الحضانة بمركب البولي إلكتروليت NELL مثل الجزيء الأول في اليوم 14. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تركيزات الجينات تؤثر على استقرار الميكروبيد. بالنسبة للجينات المشععة ، طلبنا أربعة بالمائة من الاتجاه. بالنسبة للنظراء غير المشععين ، طلبنا اتجاهين في النسبة المئوية.

باتباع هذه الإجراءات ، يمكننا زيادة تحميل عامل النمو عن طريق طلاء متعدد الطبقات. تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال هندسة الأنسجة باستكشاف توصيل عامل النمو في نماذج الأمراض الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يمكنك تصنيع مركب البولي إلكتروليت بتوزيع ضيق الحجم.