فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

الهدف العام من هذا المقايسة هو تحديد تأثيرات المعالجات محل الاهتمام على الالتصاق الخلوي تحت ظروف إجهاد القص. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تأشير الخلايا المناعية، مثل العوامل التي تتوسط تنشيط الإنتغرين. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية دراسة أزواج جزيئات الالتصاق الإنتغرين المنفردة في نظام تدفق سهل التكرار.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تنشيط LFA1، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا في دراسة إنتغرينات أخرى. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في استخدام هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الإعداد التقني يجب أن يُنفذ بدقة. ولحصاد خلايا CHO-ICAM، تُعالج المزرعة بـ 0.5%trypsin EDTA لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف.

عندما تبدأ الخلايا في الانفصال، يتم تحييد التريبسين بإضافة أربعة ملليلترات من الوسط الغذائي الطازج، ثم يتم عد عدد الخلايا المنفصلة. تخفف الخلايا لتصل إلى تركيز 0.75 × 10⁵ خلية لكل غرفة، ثم يتم تجميعها باستخدام جهاز الطرد المركزي. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الراسب في 30 µL لكل غرفة تدفق، وذلك باستخدام وسط زراعة CHO-ICAM كامل، ثم يتم استزراع حصص من الخلايا بحجم 30 µL ببطء في كل خزان من خزانات غرفة التدفق.

اترك الخلايا تستقر في حضانة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق. ثم أضف 200 µL من وسط الزرع الكامل في كلا الخزانين لكل غرفة، وأعد الطبق إلى الحضانة للزرع طوال الليل. بعد حصاد الخلايا التائية (T cells)، قم بعدّ معلق الخلايا وتخفيفه للوصول إلى تركيز 2 × 10⁶ خلية لكل غرفة.

بعد ذلك، يتم طرد الخلايا مركزياً وإعادة تعليق الراسب في 1 mL من PBS، مضافاً إليه 1% glucose لكل 2 × 10⁶ من الخلايا التائية (T cells). تالياً، يتم وسم الخلايا التائية في تخفيف بنسبة 1 إلى 1000 من CFSE، مع الحماية من الضوء لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة التحضين، يتم طرد الخلايا مركزياً وإعادة تعليق الراسب في 240 µL من وسط RPMI الخالي من المصل لكل حجرة.

بعد ذلك، قم بتوزيع الخلايا في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر، بمعدل أنبوب واحد لكل حجرة، واحفظ الأنابيب في كتلة تسخين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يحين وقت التحميل. وقبل التصوير، قم بتدفئة حجرة التصوير الحي للمجهر حتى تصل إلى 37 درجة مئوية، واملأ زجاجة زجاجية سعة 500 ملليلتر بالماء. اصنع ثقبين في الغطاء وقم بتسميتهما "مدخل" و"مخرج"، ثم مرر خرطوم توصيل المحقنة عبر ثقب المدخل، وخرطوم توصيل خزان الإمداد عبر ثقب المخرج.

استخدم محقنة سعة 60 مل لشطف خرطوم الإدخال بـ 60 مل من الماء، يليه 60 مل من وسط خالي من المصل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لإزالة أي هواء من النظام. وعندما يتم تحضير الخرطوم، انقل إعدادات الإدخال بالكامل إلى غرفة التصوير الحي في المجهر للحفاظ على النظام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بتمرير الخرطوم والمحقنة إلى خارج الغرفة، ثم ضع المحقنة في مضخة المحاقن.

بعد ذلك، قم بعمل ثقب في غطاء زجاجة سعة 250 milliliter لتكون بمثابة حاوية نفايات المخرجات، ومرر أنبوب المخرجات عبر الثقب إلى داخل الزجاجة. ثم أغلق غطاء زجاجة المخرجات بشكل فضفاض وضع منظومة المخرجات بالكامل داخل غرفة التصوير الحي. الآن، ضع شريحة غرفة التدفق على منصة المجهر، واستخدم العدسة الشيئية 20X لضبط المستوى البؤري على طبقة CHO ICAM الأحادية.

بعد ذلك، وبالبدء بعينة التحكم غير المحفزة، تخلص من ثلاثة أحجام تبلغ 70 µL من خزان المخرج في الغرفة الأولى، وأضف ثلاثة أحجام تبلغ 70 µL من الخلايا التائية المميّزة بـ CFCS إلى خزان المدخل. وأثناء انتقال الخلايا التائية من المدخل إلى المخرج، صوّر خمسة حقول عشوائية للخلايا التائية الموجبة لـ CFSE في كل غرفة للحصول على تعداد الخلايا قبل التدفق. بعد ذلك، قم بتوصيل خراطيم المدخل والمخرج في آن واحد بخزانات غرفة التدفق، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات هواء، وابدأ تدفق إجهاد القص بمعدل 0.3 mL/min، مع الاستمرار في معاينة الخلايا التائية المصبوغة بـ CFSC بصرياً.

بمجرد ملاحظة حركة الخلايا التائية T cells، ابدأ مؤقتًا لمدة خمس دقائق، وأوقف التدفق عند نهاية هذه الفترة. بعد ذلك، قم بتصوير خمسة حقول من الخلايا الموجبة لـ CFSE في كل غرفة، مع اختيار الحقول عشوائيًا للحصول على تعداد الخلايا بعد التدفق. وبالنسبة لتحفيز PMA، قم بتحفيز أنبوب واحد من الخلايا التائية T cells باستخدام PMA ليكون بمثابة ضابط موجب مباشرة قبل تحميل الخلايا التائية في غرفة التدفق الثانية للتصوير، كما تم توضيحه للتو.

لتحفيز SDF-1 alpha، قم أولاً بسحب ثلاث حصص حجم كل منها 70 µL من الوسط من خزان المخرجات في الغرفة الثالثة، ثم أضف 70 µL من SDF-1 alpha إلى خزان المدخلات. بعد خمس دقائق، تخلص من ثلاث حصص حجم كل منها 70 µL من خزان المخرجات، وأضف الأنبوب المتبقي من الخلايا التائية (T cells) للتصوير، كما تم توضيحه للتو. في هذه الصور التمثيلية، يُلاحظ وجود عدد مماثل من الخلايا التائية (T cells) قبل التدفق تحت ظروف التحفيز المختلفة.

بعد خمس دقائق من إجهاد القص المستمر، يزداد عدد الخلايا التائية الملتصقة تحت ظروف التحفيز بـ PMA وSDF-1 alpha، بينما تظل قلة من الخلايا التائية غير المحفزة ملتصقة. وبالفعل، يؤدي تنشيط الخلايا التائية بواسطة SDF-1 alpha، على سبيل المثال، إلى زيادة تقارب ضعفين في التصاق الخلايا التائية، مقارنة بالخلايا الضابطة غير المحفزة. علاوة على ذلك، عند حساب النسبة المئوية لالتصاق الخلايا التائية البشرية الأولية الموجبة لـ CD3 في وجود أو غياب SDF-1 alpha، فإن 15% من الخلايا التائية غير المحفزة تلتصق تحت إجهاد القص، مقارنة بـ 50% من الخلايا التائية تحت ظروف التنشيط بـ SDF-1 alpha.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن توسيع نطاقها بشكل معقول ليشمل ست غرف تجريبية في تحليل واحد. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل فقط مع طبقة ICAM الأحادية الملتئمة. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تحليل شكل الخلية، على الصور الملتقطة للإجابة على أسئلة إضافية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية قياس التصاق الخلايا تحت ظروف إجهاد القص. شكراً لمشاهدتكم هذا الفيديو، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.