العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوسيع الخلايا اللحمية الجذعية الوسيطة المشتقة من أنسجة المشيمة البشرية. مرحبا ، أنا مايك دوران. أنا قائد مجموعة في جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا في معهد البحوث الانتقالية في بريسبان ، أستراليا.

مرحبا ، اسمي ريبيكا بيليكانوس ، وأنا باحثة في مركز جامعة كوينزلاند للأبحاث السريرية. اليوم ، سأعرض إجراء عزل MSC. عادة ما يتم التخلص من المشيمة بعد الولادة.

نظرا لأن وزن الأنسجة يتراوح من خمسة إلى 700 جرام ، فإنه يوفر مصدرا كبيرا بشكل فريد للخلايا الجذعية الوسيطة الخيفية. بشكل عام ، سيكافح الأشخاص الجدد في عزل MSC المشيمية لأنهم ليسوا على دراية بتشريح المشيمة وليسوا على دراية بكيفية معالجة الأنسجة وغير على دراية بنوع الخلايا ، الأم أو الجنين ، التي ستملأ مزرعة MSC النهائية. لمساعدة الباحثين ، نناقش هذه التفاصيل المهمة في هذا الفيديو.

الخطوة الأولى في هذا الإجراء هي توجيه نفسك بتشريح المشيمة. الخطوة الثانية في هذا الإجراء هي تشريح 10 جرامات من الأنسجة يدويا إما من الطبقة أو الزغابات المشيمية أو الصفيحة المشيمية باستخدام المقص. تلخص الخطوات الأولى ثانية هنا بشكل تخطيطي.

في الخطوة الثالثة ، يتم تقطيع الأنسجة الديسيدوا أو الزغابات المشيمية أو أنسجة الصفيحة المشيمية إلى قطع رفيعة بالمقص. في الخطوة الرابعة ، يتم تحرير الخلايا من القطع الصغيرة من الأنسجة عن طريق الهضم لمدة ساعة إلى ساعتين في التباين والكولاجيناز I.In الخطوة الخامسة ، يتم فصل الخلايا عن الأنسجة الليفية عن طريق غسلها من خلال مصفاة خلوية. ثم يتم جمع الخلايا ، وإعادة تعليقها في وسط الثقافة ، ووضعها في قوارير الثقافة.

سيتم اختيار الخلايا اللحمية الوسيطة ، الخلايا الجذعية الجذعية ، بناء على ميلها إلى التصاق البلاستيك وقدرتها على البقاء والتكاثر في وسط زراعة الخلايا. أخيرا ، في قسم النتائج ، يمكن توصيف MSC الموسع وتخزينه لاستخدامه في التجارب المستقبلية. المشيمة هي عضو مؤقت يسمح بتبادل العناصر الغذائية والفضلات بين الجنين والأم أثناء الحمل.

يمكن بسهولة جمع المشيمة بشكل عقيم بعد الولادة القيصرية والولادة الآمنة للطفل. تتكون المشيمة في الغالب من الأوعية الدموية والأغشية المشتقة من الجنين. ومع ذلك ، فإنه يحتوي أيضا على بعض خلايا الأم.

ترتبط المشيمة بالرحم بواسطة كل من الخلايا المتساقطة الأم المشتقة من الرحم والأرومات الغاذية الغازية المشتقة من الجنين. لا يمكن عادة تمييز الواجهة الدقيقة بين أنسجة الأم والجنين بالعين. ومع ذلك ، يمكن التعرف بسهولة على الجانب الجنيني من المشيمة على أنه الجانب الذي يوجد فيه الحبل السري.

عندما يتم ولادة الطفل ، تبقى طبقة رقيقة فقط من الأنسجة المتقطعة متصلة بالمشيمة. من خلال التوجيه الجسدي للمشيمة ، من الممكن تحديد الأنسجة الثلاثة التي سنحصدها اليوم. سيتم حصاد الأنسجة الأولى هي الأم decidua.

تشير العلامة الخضراء إلى الأنسجة المتساقطة التي تبقى على السطح بعد التخلص من المشيمة من جدار الرحم. النسيج الثاني الذي سيتم حصاده من داخل المشيمة هو الزغابات المشيمية الجنينية. يشار إلى ذلك من خلال الدوائر الزرقاء على الرسوم البيانية.

النسيج الثالث الذي سيتم حصاده هو صفيحة المشيمية الجنينية. يتم التعرف على هذا النسيج من خلال العلامات الحمراء الموجودة على المخططات. حسنا ، هيا بنا نبدأ.

ضع المشيمة في خزانة السلامة البيولوجية. افتح أغشية الجنين ووجه نفسك بأجزاء المشيمة. الجانب الجنيني مع إدخال الحبل السري ، أو المشيمة السلى ، أو الكيس الأمنيوسي.

يحتوي سطح الجنين في المشيمة على أوعية دموية كبيرة واضحة في الصفيحة المشيمية ، مع غشاء يسوي يغطي ، والذي ، مرة أخرى ، يمكن فصله ميكانيكيا بسهولة. الجانب الأم هو عكس الجانب الجنيني ، مع وجود فلقات أو فصوص واضحة. تأكد من أن سطح الأم متجها لأعلى.

قطع قطع بسمك 0.5 سم من جانب الأم من المشيمة أو ديسيدوا. أثناء التشريح ، ضع قطع المناديل في طبق بتري يحتوي على محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، للحفاظ على الأنسجة رطبة. حرك الأنسجة في الأطباق باستخدام HBSS لإزالة بعض الدم.

نقل أنسجة كافية لملء الأنبوب حتى علامة 10 مليلتر لأنبوب 50 ملليلتر ، حوالي 10 جرام. لاحظ أنه يمكن عزل المزيد من الأنسجة في هذه المرحلة إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الخلايا في نهاية الإجراء. تأكد من أن سطح الجنين متجها لأعلى.

قم بإزالة الغشاء الأمنيوسي ميكانيكيا من سطح الجنين في المشيمة ، مع ترك الصفيحة المشيمية سليمة. قطع الصفيحة المشيمية إلى شرائح بعمق نصف سنتيمتر تقريبا في أنسجة الزغابات تحتها. بعد ذلك ، قم بتشريح أنسجة الزغابات المشيمية بعمق سنتيمتر واحد تقريبا في المشيمة حيث تمت إزالة الصفيحة المشيمية منها.

ضع الأنسجة في HBSS وقم بقياس ما يقرب من 10 ملليلتر من الأنسجة كما كان يحدث سابقا. انقل قطع المناديل ، مع الحد الأدنى من نقل السوائل ، إلى طبق بتري 10 سم وقم بتقطيعها إلى قطع رفيعة تقريبا ملليلتر مكعب واحد ، باستخدام مقص. انقل الأنسجة المفرومة مرة أخرى إلى أنبوب 50 مل.

كرر ذلك مع جميع عينات الأنسجة المتبقية. أضف وسائط الهضم المحضرة حديثا بنسبة واحد إلى واحد على الأقل مع الأنسجة. اقلب الأنبوب عدة مرات للخلط.

احتضان الأنسجة في الأنبوب بوسائط الهضم لمدة ساعة إلى ساعتين ، عند 37 درجة في حاضنة اهتزازية. عندما يتغير محلول هضم الأنسجة إلى مظهر غائم ، وكانت الأوعية الدموية البيضاء واضحة في المحلول ، أضف 15 مل من HBSS لتخفيف الإنزيمات في وسط الهضم. نبض العينات لفترة وجيزة فقط حتى يصل جهاز الطرد المركزي إلى 340 جم لمدة خمس ثوان ، ثم توقف.

سيؤدي ذلك إلى إجبار الحطام الكبير على التجمع في قاع الأنبوب. أعد العينات إلى خزانة السلامة البيولوجية. ضع مصفاة خلوية في أنبوب جديد سعة 50 مل.

الماصة المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا أحادية النواة في المصفاة ، وتلتقط الشطف في الأنبوب الجديد. اترك بقايا أنسجة المشيمة في الأنبوب الأول. أضف 15 مل من HBSS إلى حطام المشيمة ، ورجها بقوة لاستعادة المزيد من الخلايا ، وقم بنبض الطرد المركزي للعينة.

مرة أخرى ، قم بإدخال المادة الطافية في الأنبوب باستخدام مصفاة الخلية في أنبوب التجميع. قد يكون صب المادة الطافية في مصفاة الخلية أكثر ملاءمة ، اعتمادا على تناسق العينة. اغسل مصفاة الخلية ب 5 ملليلتر من HBSS.

تخلص من الأنبوب الذي يحتوي على بقايا أنسجة المشيمة. الطرد المركزي عينة المادة الطافية لمدة خمس دقائق عند 340 جم لحبيبات الخلايا. تظهر خلايا الدم الحمراء كطبقة في الجزء السفلي من الحبيبات ، والخلايا أحادية النواة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجذعية هي الطبقة الأخف فوق خلايا الدم الحمراء.

أعد العينات إلى خزانة السلامة البيولوجية. صب بعناية المادة الطافية والتخلص منها. نفض الغبار عن الأنبوب عدة مرات بإصبع لإزاحة حبيبات الخلية, وأعد تعليق حبيبات الخلية في 35 مل من وسائط MSC.

انقل تعليق الخلية إلى قارورة T175 واحدة لكل 10 مل من الأنسجة ، وزراعتها في حاضنة 37 درجة مع 5٪ CO2. بعد العزل ، قم بتغيير وسائط الثقافة بعد 48 ساعة. قم بإطعام الثقافات مرة واحدة في الأسبوع حتى تلتقي.

يجب أن تتلاقى الثقافات بحوالي 14 يوما. أخيرا ، قم بتوسيع الخلايا وحفظها بالتبريد ، وتحليل خصائص MSC ، واستخدامها في التجارب. بعد 48 ساعة من الثقافة ، سيكون MSC مرتبطا ببلاستيك زراعة الأنسجة ، في حين أن الخلايا المكونة للدم ومجموعات الخلايا الأخرى لن تمتلكها.

في هذا الوقت ، يتم استبدال الوسيط ب 35 مل من وسط الثقافة الطازجة. يمكن أن يختلف مظهر المادة الطافية المزروعة اختلافا كبيرا بين المتبرعين بالمشيمة. يوضح المثال الأول والثاني هذا الاختلاف.

تم إجراء هاتين العزلتين في وقت واحد ، ولكن من مشيمين مختلفين. بمجرد غسلها ، تكون الثقافات خالية من خلايا الدم الحمراء وبقايا الأنسجة كما هو موضح في المثال الثالث ، وتكون نتائج التمدد اللاحقة متسقة بشكل عام. بعد تغيير الوسائط لمدة 48 ساعة ، يتم توصيل عدد قليل فقط من الخلايا بالقارورة.

بعد سبعة أيام من العزلة ، تظهر مستعمرات الخلايا الجذعية الجذعية الليفية ، على الرغم من وجود خلايا غير MSC أيضا ، كخلايا مستديرة أو متصلة بشكل فضفاض. بعد 13 يوما من العزلة ، تكون مستعمرات MSC الليفية كبيرة ، وغالبا ما تكون الطبقة الأحادية من MSC ملتصقة بدرجة كافية وجاهزة للمرور. من المرور إلى ما بعده ، تطور الطبقة الأحادية MSC مورفولوجيا مميزة تشبه الدوامة عند التقاء.

يعرض MSC المشيمي ملف تعريف علامة MSC الكلاسيكي عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. الخلايا إيجابية ل CD73 و CD105 و CD90 ، وسلبية لعلامات المكونة للدم CD45 و CD34 و HLA-DR. تخضع MSC المشيمية بشكل عام لتمايز قوي للعظم ولكن تمايز شحمي ضعيف.

تفترض العديد من المنشورات أن الخلايا المعزولة من المشيمة الجنينية تنتج MSC للجنين عند الاستزراعة. ومع ذلك ، كما ذكرنا سابقا ، فإن جميع الثقافات المشتقة من المشيمة الجنينية باستخدام هذا البروتوكول تصبح غنية بسرعة لزراعة MSC للأم ، كما هو متوقع لمزارع MSC النفضية الأمومة. تحدد البيانات الموضحة هنا تكوين الخلايا الجنينية والأمومية لمزارع MSC المشيمية المعزولة من أنسجة الصفيحات المتساقطة والمشيمية وأنسجة الصفيحة المشيمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل واستزراع MSC المشتق من أنسجة المشيمة. نأمل أن تجد هذه الأساليب مفيدة في أبحاثك وتطبيقاتك السريرية التي قد تستخدم الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من المشيمة.