تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني

الهدف العام لتقنية المجهر الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي هو تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا وهيكلها وتوزيعها وحجمها وعددها في منطقة محددة من دماغ الفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب ، مثل ما إذا كانت التغييرات في بنية الميتوكوندريا في الدماغ وعددها وتوزيعها تساهم بشكل كبير في الاضطرابات التنكسية العصبية والنمو العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعمل على أتمتة عملية تصوير المقاطع التسلسلية من خلال دمج ميكروتوم فائق الصغر مخصص مدمج في غرفة المجهر الإلكتروني المسح الضوئي المنخفض الفراغ.

لبدء التجربة ، اغسل الأنسجة المثبتة بالجلوتارالديهايد المعدة مسبقا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في محلول كاكوديلات 0.1 مولار. بعد إصلاح الأنسجة ب 1 ملليلتر من حمض التانيك المخزن 0.1٪ من الكاكوديلات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، اغسل الأنسجة في عازلة الكاكوديلات.

قم بإذابة 0.3 جرام من فيروسيانيد البوتاسيوم و 0.86 جرام من كاكوديلات الصوديوم في 10 مل من الماء المقطر. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف 10 مل من 4٪ رابع أكسيد الأوزميوم وصمة للأنسجة بمحلول فيروسيانيد الأوزميوم 2٪ لمدة 90 دقيقة على الثلج. بعد تلطيخ ، اغسل المنديل بالماء المقطر.

عالج العينات بمحلول 1٪ ثيوكاربوهيدرازيد أو محلول TCH المحضر حديثا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل العينات. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأنسجة ب 2٪ رابع أكسيد الأوزميوم المائي لمدة ساعة واحدة.

بعد تلطيخ ، اغسل الأنسجة بالماء المقطر. احتضان العينات طوال الليل في 1٪ أسيتات اليورانيل في الماء المقطر عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف المناديل بالماء المقطر واحتضانها بصبغة الأسبارتات الرصاصية من ويلتون في الفرن.

يعد الحصول على أفضل تلطيخ ممكن للأنسجة أمرا بالغ الأهمية للتصوير ، حيث يؤدي التلوين السيئ إلى ظاهرة شحن على العينة تجعل التصوير صعبا أو مستحيلا. اغسل المنديل بالماء المقطر. قم بتجفيف العينات من خلال سلسلة متدرجة من الكحول باستخدام محاليل مبردة من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل منها ، متبوعة بتجفيف الإيثانول بنسبة 100٪ ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.

اغسل العينات مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منها بأكسيد البروبيلين. ضع الأنسجة في مزيج 1: 1 من راتنج التضمين وأكسيد البروبيلين ، وقم بتغطية القارورة ، واحتضن الأنسجة طوال الليل. قم بفك غطاء القارورة بعد ساعتين حتى يتبخر أكسيد البروبيلين خلال فترة التسع ساعات.

انقل المناديل إلى راتنج مدمج طازج بنسبة 100٪ في قوارير نظيفة لمدة ساعتين. قم بتضمين العينات في راتنج التضمين الطازج في قوالب مسطحة تحتوي على ملصقات ورقية مطبوعة ومعالجتها في الفرن. بعد ساعة واحدة ، تحقق من وضع الأنسجة ومحاذاة الأنسجة واضبطها إذا لزم الأمر.

قم بقص العينات إلى منطقة الاهتمام وقم بتثبيتها على دبوس من الألومنيوم باستخدام الغراء الفائق cyanoacrylate. ثم قم بتغطية العينة بعجينة فضية غروية حول جوانب الكتلة لتوفير مسار موصل لدبوس الألومنيوم. افحص عينات الأنسجة باستخدام نظام مجهر إلكتروني ماسح مجهز بمرحلة فائقة الميكروتوم داخل الغرفة وكاشف إلكترون منخفض الكيلو فولت.

قم بتصوير العينات باستخدام هذه الإعدادات. ابدأ التحليل عن طريق تحديد الصورة والنوع ثم 8 بت لتحويل الصور إلى تنسيق TIFF 8 بت من 16 بت الأصلي. إذا لم يكن التباين التلقائي و/أو تحويل السطوع أثناء هذه الخطوة مثاليا للصور، فأعد فتح الصور بمعدل 16 بت واضغط على Image, Just, Brightness/Contrast.

حدد نطاقا يناسب جميع الصور واضغط على تطبيق. ثم قم بإجراء التحويل. إذا كانت هناك حركة صورة غير مقبولة بين الشرائح، فقم بمحاذاة مكدسات الصور عن طريق تحديد المكونات الإضافية والتسجيل ومحاذاة المكدس الخطي مع SIFT وتعيين المحاذاة لوضع الترجمة فقط بدلا من الجسم الصلب.

قم بتكبير حجم اللوحة القماشية قبل التسجيل عن طريق تحديد الصورة ، ضبط ، حجم اللوحة القماشية. بدلا من ذلك ، قم بتقليل الصورة إلى منطقة اهتمام عن طريق تحديد المنطقة المطلوبة ثم اقتصاصها. إذا لزم الأمر، قم بتغيير حجم الصور إلى حجم أصغر وأكثر قابلية للإدارة باستخدام ImageJ، ثم حدد الصورة والمقياس.

أظهر الفحص المجهري متحد البؤر على الثقافات العصبية منخفضة الكثافة أن الميتوكوندريا الموجودة في سوما العصبية تشكل شبكة شبكية ، في حين أن أولئك الذين يقيمون في الخلايا العصبية البعيدة يظهرون مورفولوجيا ممدودة منفصلة. باستخدام المجهر الإلكتروني المتسلسل للمسح الضوئي للوجه الكتلي ، أو تقنية SBFSEM ، لوحظت بوضوح الميتوكوندريا والتشعبات والدوالي المحورية في دماغ الفأر. أظهرت عمليات إعادة بناء الميتوكوندريا لمدة ثلاثة أيام في الخلايا العصبية في أنسجة دماغ الفئران اختلافا في الحجم بين الميتوكوندريا الشجيرية والمحورية.

كشفت البيانات المستخرجة من صورة تمثيلية ثنائية الأبعاد SBFSEM أن حجم أو حجم الميتوكوندريا الموجودة داخل المشابك العصبية كان أصغر بكثير من تلك الموجودة في المنطقة خارج المشبكي. توفر الصور التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل SBFSEM دقة متزايدة لرؤية الخصائص البنية التحتية للميتوكوندريا الفردية. من الممكن تصنيف المقصورة الخلوية للميتوكوندريا من خلال تحديد قربها من الهياكل التي يمكن التعرف عليها بسهولة مثل الميتوكوندريا الجسدية غير المتشابكة والميتوكوندريا قبل المشبكي.

يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي سبعة أيام ، والتي تشمل ثلاثة أيام من التلوين ، ويومين للمعالجة بالراتنج ، ويوم واحد من التصوير لإنتاج كومة مناسبة لهذا التحليل ، وحوالي ساعتين إلى أربع ساعات للمعالجة اللاحقة للصور استعدادا للتحليل. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لتصوير الميتوكوندريا مثل التصوير الحي باستخدام الميتوكوندريا المسماة وراثيا للإجابة على أسئلة حول الاتجار بالميتوكوندريا وديناميكيات انشطارها واندماجها.