مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة دقة انفصال الكروموسومات أثناء الانقسام الفتيلي في جنين سمكة الزيبرا الحي، وذلك باستخدام بروتينات الكروماتين وأغشية الخلايا المـُوسومة فلوروسنتياً، والتي سيتم رصدها باستخدام المجهر البؤري عالي الدقة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الانقسام الفتيلي، مثل: كيف تؤدي عيوب الانقسام الفتيلي إلى خلل نمائي، أو إلى تكوين أورام في كائن فقاري حي؟ وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أننا نراقب الانقسام الفتيلي في كائن فقاري حي، مما يسمح بجمع بيانات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية.

بعد تزويج أسماك الزيبرا البالغة وحقن البيض بـ H2A. F/Z-EGFP و/أو pCS2 mCherry-CAAX RNA، وقبل التصوير بنحو ساعتين، استخدم مجهراً تشريحياً فلورياً لتحديد الأجنة الموجبة لـ GFP. انقُل الأجنة التي تُظهر تعبيراً قوياً عن GFP باللون الأخضر الساطع إلى طبق بتري جديد مقاس 100 في 15 مليمتر يحتوي على وسط E3 blue.

قم بغلي محلول مخزون من الأجاروز منخفض الانصهار بنسبة 1% في E3 blue. وزع ثلاثة ملليلتر من الأجاروز المصهور في أنبوب زراعة بحجم 17 في 100 مليمتر. حافظ على دفء الأجاروز بوضع أنبوب الزراعة في حمام مائي عند درجة حرارة 42 درجة مئوية حتى يحين وقت الاستخدام.

قم بتجهيز تريكين بتركيز 15-millimolar، والأجنة التي تم فحصها، وأجاروز منخفض الانصهار، وE3 blue، وطبق زرع زجاجي بقطر 35-millimeter وقاعدة غطاء شريحة، ومجهر تشريحي ضوئي. بعد ذلك، باستخدام ملاقط رقم خمسة، قم بإزالة الغشائية (chorions) بعناية من ثلاثة أجنة، وضع الأجنة في وعاء منفصل لتخديرها. ثم، باستخدام ماصة نقل، أضف ثلاث قطرات من تريكين بتركيز 15-millimolar إلى الطبق الذي يحتوي على الأجنة وخمسة milliliters من الوسط.

أضف ثلاث إلى أربع قطرات من محلول التريكاين بتركيز 15 millimolar إلى أنبوب الأجاروز المذاب بتركيز 1% . وعندما يتم تخدير الأجنة بشكل كافٍ، استخدم ماصة Pipetman P200، بعد قطع سنتيمتر واحد من طرف الماصة، لنقل الأجنة المخدرة إلى الطبق ذو القاعدة المكونة من غطاء شريحة. قم بإزالة أي كمية زائدة من محلول E3 blue tricaine.

أضف ببطء من 5 إلى 10 µL من محلول الأجاروز منخفض الانصهار والتريكاين فوق الأجنة، مع الحفاظ على كل قطرة منفصلة، لضمان عدم انجراف الأجنة واقترابها من بعضها البعض. بعد ذلك، وباستخدام إبرة قياس 21 وبطول 1.5، وجه الأجنة بلطف داخل الأجاروز إلى الموضع المطلوب، مع توجيه المنطقة المستهدفة لتكون أقرب ما يمكن من غطاء الشريحة في حال استخدام مجهر مقلوب. ونظراً للإزاحة التي قد تحدث، قد يكون من الضروري العودة إلى كل جنين للتأكد من بقائها في الموضع المطلوب.

قد يتطلب الأمر تكرار هذه العملية عدة مرات حتى يتم تحقيق الوضع المثالي أثناء تجميد الآغار. وبعد مرور بضع دقائق، لاختبار ما إذا كان قد تماسك، استخدم إبرة لكسر قطعة صغيرة من الآغاروز. وعندما يصبح من الممكن سحبها بعيداً عن القطرة، استخدم المزيد من الآغاروز منخفض الانصهار لتشكيل قبة فوق الأجنة المدمجة، بحيث تغطي غطاء الشريحة بالكامل.

أثناء تصلب الأغاروز، قم بتحضير ثلاثة ملليلتر من وسط E3 blue مع خمس قطرات من تريكاين بتركيز 15-ميلليمولار، ليتم وضعها فوق الأجنة المغمورة أثناء التصوير. لإجراء التصوير المجهري البؤري خماسي الأبعاد (5D confocal imaging) لأجنة zebrafish الحية، افتح برنامج التصوير، واضبط المجهر على عدسة بقوة تكبير 60X وفتحة عددية 1.4. ضع زيت الغمر على العدسة، ثم ضع طبق الزرع في حامل الشرائح على منصة المجهر.

باستخدام وحدة التحكم في المحاور، قم بتوسيط الجنين المطلوب فوق العدسة الشيئية، ثم ارفع العدسة لتلامس طبق الزرع. اسكب محلول E3 blue ومحلول التريكاين فوق الأجنة المدمجة في الآجار. بعد ذلك، انقر فوق أيقونة منفذ العين (Eye Port) لعرض الأجنة من خلال العدسة العينية.

قم بتعطيل تحديد منفذ العين (Eye Port)، ثم اختر View، ثم Acquisition Controls، ثم A1 Scan Area، لفتح أداة A1 Scan Area. حدد قناة GFP، وأعد تشغيل المسح، وقم بالتركيز على منطقة اهتمام قريبة من الغطاء الزجاجي (coverslip). أوقف المسح، وحدد قناتي GFP وmCherry، واضبط خيار متوسط الخطوط (line-averaging) على الوضع العادي.

الآن، اختر View، ثم Acquisition Controls، ثم ND Acquisition، لفتح أداة A1 ND Acquisition. ابدأ عملية المسح. بعد ذلك، وباستخدام وحدة التحكم في المحاور، قم بضبط وضعية الأجنة بحيث تمتلئ منطقة المسح بأكبر قدر ممكن من سمكة الزيبرا.

اضبط الحد العلوي لمجموعة Z-stack عند النقطة التي تصبح فيها الخلايا خارج نطاق التركيز، مع ترك مسافة إضافية قدرها 3 µm فوق العينة، للسماح بالنمو وحركة الخلايا. بعد ذلك، اضبط الحد السفلي عند النقطة التي لا تعد فيها الخلايا مرئية، واضبط حجم خطوة الفاصل الزمني لـ Z-interval على 2 µm. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا، قم بتعديل قدرة ليزر التصوير، أو الجهد العالي (HV) أو الكسب (gain)، ومستويات الإزاحة (offset)، على التوالي، كما هو مدرج أدناه.

بمجرد ضبط المعلمات، قم بإيقاف المسح لمنع التعرض غير الضروري لليزر الذي قد يسبب السمية الضوئية والبهتان الضوئي للعينة. الآن، اختر أيقونة متوسط الخطوط 2X، والتي توفر أفضل جودة للصورة وأسرع وقت للمسح. حدد الفاصل الزمني ومدة الوقت المناسبين والضروريين للتجربة.

بالنسبة لانقسامات الخلايا من النوع البري، تعتبر الفواصل الزمنية التي تبلغ دقيقتين لمدة ساعتين كافية لتحديد مدة الانقسام الميتوزي. أما الانقسامات التي تنشط نقطة تفتيش تجميع المغزل لمدة تزيد عن ثلاثين دقيقة، فتكون الفواصل الزمنية التي تتراوح بين أربع إلى خمس دقائق لمدة أربع ساعات أكثر ملاءمة، وذلك للحفاظ على الفلورة، كما هو موضح هنا. ولحفظ الملف تلقائياً أثناء عملية الحصول على الصور، قم بتحديد مربع "Save to File" وقم بتسمية الملف.

أخيرًا، تأكد من ضبط جميع المعلمات بشكل صحيح، ثم اضغط على Run Now. وبعد اكتمال عملية الاستحواذ، ولعرض الملف بتنسيق ثلاثي الأبعاد، انقر على أيقونة Volume Threshold. يوضح هذا الشكل القدرة على مراقبة العديد من انقسامات الخلايا باستخدام مجال رؤية واسع لذيل سمكة zebrafish من السلالة البرية AB.

يُشار إلى انقسامات الخلايا بعلامات النجمة. ويظهر المقطع المرئي المقابل هنا. وبشكل متوسط، لوحظ 50 خلية منقسمة في AB، و30 خلية منقسمة في طفرة aurora B.

لتعويض النقص في عدد الخلايا الانقسامية التي تم تصويرها في جنين طفرة aurora B، تم حساب نسبة الخلايا الانقسامية إلى عدد الخلايا المصورة، مما يشير إلى عدم وجود انخفاض في عدد الخلايا التي تمر بعملية الانقسام في أجنة طفرة aurora B، بل هناك عدد إجمالي أقل من الخلايا التي تم تصويرها. ولتقدير مدة الانقسام الفتيلة، يتم ضرب عدد الفترات الزمنية التي تستغرقها عملية انقسام خلية واحدة في الفاصل الزمني بين كل Z-stack. وكما يظهر في هذا الرسم البياني، يبلغ متوسط وقت انقسام النوع البري AB 25 دقيقة، و58 دقيقة لطفرة aurora B.

كما هو ملاحظ في أجنة النوع البري، يمكن تمييز كل طور من أطوار الانقسام الميتوزي. ومع ذلك، تُلاحظ عيوب ميتوزية في جنين طافر لبروتين aurora B، تشمل التوقف الميتوزي وفشل عملية تقسيم السيتوبلازم، مما يؤدي إلى تكوين خلية ثنائية النواة، وما يلي ذلك من تشكل نوى صغيرة، وهو ما يدعم زيادة وقت الانقسام المقاس في هذا الطافر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعة واحدة، بدءاً من فحص الأجنة وصولاً إلى ضبط معايير المجهر البؤري.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر سياق التجربة الحالية، فيما يتعلق بالمنطقة المستهدفة، والمدة الزمنية، والفاصل الزمني، والعمق في المحور Z. سيساعد ذلك في رفع الكفاءة إلى أقصى حد، فضلاً عن منع حدوث التبييض الضوئي والسمية الضوئية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل فروق الكروموسومات، للإجابة على أسئلة إضافية حول سبب العيوب الملاحظة في الانقسام الميتوزي، أو استخدام علاج دوائي لتحديد التأثيرات على تقدم الانقسام الميتوزي، أو مدته، أو مصير الخلية.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا لاستكشاف الانقسام الفتيلي في سياق بيولوجيا التطور وبيولوجيا السرطان باستخدام أسماك الزيبرا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تثبيت أجنة أسماك الزيبرا، والتقاط صور حية للانقسام الفتيلي، وتحليل تكرار الانقسام الفتيلي ومدته ومصير الخلية. لا تنسَ أن العمل باستخدام الليزر عالي الطاقة والضوء الفلوري قد يكون ضاراً للعينين، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً، مثل تجنب الاتصال المباشر للعين بالليزر، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.