مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة دقة فصل الكروموسوم أثناء الانقسام في جنين الزرد الحي باستخدام بروتينات الكروماتين وغشاء الخلية المسمى بفلورسينت والتي سيتم التقاطها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الانقسام ، مثل كيف تؤدي العيوب الانقسامية إلى عيب في النمو ، أو تكوين ورم في كائن فقاري حي؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نلاحظ الانقسام في كائن فقاري حي يسمح بجمع البيانات ذات الصلة من الناحية الفيزيولوجية.

بعد تربية الزرد البالغ وحقن البيض ب H2A. F / Z-EGFP و / أو pCS2 mCherry-CAAX RNA ، قبل ساعتين تقريبا من التصوير ، استخدم مجهر تشريح الفلورسنت لتحديد الأجنة الإيجابية ل GFP. انقل الأجنة الخضراء الزاهية التي تعبر عن GFP إلى طبق بتري جديد مقاس 100 × 15 ملم مع وسط أزرق E3.

قم بغلي محلول مخزون من 1٪ أغاروز منخفض الذوبان باللون الأزرق E3. Aliquot ثلاثة ملليلتر من الاغاروز المذاب في أنبوب استزراع 17 × 100 ملم. حافظ على دفء الاغاروز عن طريق وضع أنبوب المزرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

اجمع 15 ملليمولار ثلاثي الكنائين ، والأجنة التي تم فحصها ، والأغاروز منخفض الذوبان ، والأزرق E3 ، وطبق ثقافة زجاجي بغطاء منزلق مقاس 35 ملم ، ومجهر ضوئي تشريح. بعد ذلك ، باستخدام الملقط رقم خمسة ، قم بإزالة المشيمات بعناية من ثلاثة أجنة ، وضع الأجنة في وعاء منفصل لتخديرها. بعد ذلك ، باستخدام ماصة النقل ، أضف ثلاث قطرات من 15 مللي مولار في الطبق الذي يحتوي على الأجنة وخمسة ملليلتر من المتوسط.

أضف ثلاث إلى أربع قطرات من محلول ثلاثي الكنائين 15 مللي مولار إلى أنبوب 1٪ من الاغاروز الذائب. عندما يتم تخدير الأجنة بشكل كاف ، باستخدام P200 Pipetman ، مع قطع سنتيمتر واحد من طرف الماصة ، انقل الأجنة المخدرة إلى طبق القاع المنزلق. قم بإزالة أي محلول ثلاثي الكنائين الأزرق E3 الزائد.

أضف ببطء خمسة إلى 10 ميكرولترات من محلول الأغاروز وثلاثاء الذخائر المنخفضة على الأجنة ، مع إبقاء كل قطرة منفصلة ، للتأكد من أن الأجنة لا تنجرف بالقرب من بعضها البعض. بعد ذلك ، باستخدام إبرة ونصف قياس 21 ، قم بتوجيه الأجنة في الاغاروز برفق إلى الموضع المطلوب ، وتوجيه منطقة الاهتمام بالقرب من الغطاء قدر الإمكان إذا كنت تستخدم مجهر مقلوب. بسبب التحول الذي قد يحدث ، قد يكون من الضروري العودة إلى كل جنين للتأكد من بقائه في الوضع المطلوب.

قد يتعين القيام بذلك عدة مرات ، حتى يتم تحقيق الوضع المثالي مع تصلب الأجار. بعد بضع دقائق ، لاختبار ما إذا كان قد تم ضبطه ، استخدم إبرة لتفكيك قطعة صغيرة من الاغاروز. عندما يمكن سحبها بعيدا عن القطرة ، استخدم agarose إضافيا منخفض الذوبان لتشكيل قبة فوق الأجنة المضمنة ، تغطي الغطاء بالكامل.

بينما يتجمد الاغاروز ، قم بإعداد ثلاثة ملليلتر من الوسط الأزرق E3 مع خمس قطرات من 15 ملليمولار ثلاثي الكنائين ، لوضعها فوق الأجنة المضمنة أثناء التصوير. لإجراء تصوير متحد البؤر 5D لأجنة أسماك الزرد الحية ، افتح برنامج التصوير ، واضبط المجهر على عدسة ذات فتحة عددية 60X 1.4. ضع زيت الغمر على العدسة ، وضع طبق الثقافة في حامل الشريحة على مرحلة المجهر.

باستخدام وحدة التحكم في المحور ، قم بتوسيط الجنين محل الاهتمام فوق العدسة الموضوعية ، وارفع العدسة لتلتقي بطبق الثقافة. صب محلول E3 الأزرق والتريكين على الأجنة المضمنة في أجار. بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة Eye Port لعرض الأجنة من خلال العدسة.

قم بتعطيل تحديد منفذ العين، واختر View وAcquisition Controls وA1 Scan Area، لفتح أداة A1 Scan Area. حدد قناة GFP ، وأعد تشغيل الفحص ، وركز على منطقة اهتمام قريبة من قسيمة الغطاء. أوقف الفحص ، وحدد قنوات GFP و mCherry ، واضبط خيار متوسط الخط على الوضع الطبيعي.

الآن ، اختر View ، Acquisition Controls ، ND Acquisition ، لفتح أداة A1 ND Acquisition. ابدأ المسح. بعد ذلك ، باستخدام وحدة التحكم في المحور ، ضع الأجنة بحيث تمتلئ منطقة المسح بأكبر قدر ممكن من الزرد.

اضبط الحد الأعلى لمكدس Z على المكان الذي تكون فيه الخلايا خارج نطاق التركيز ، مما يسمح بمساحة إضافية تبلغ ثلاثة ميكرومتر فوق العينة ، للنمو وحركة الخلية. بعد ذلك ، قم بتعيين الحد الأدنى إلى المكان الذي لم تعد فيه الخلايا مرئية ، واضبط حجم خطوة الفاصل الزمني Z على ميكرومترين. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا ، اضبط طاقة الليزر التصويرية ، HV أو الكسب ، ومستويات الإزاحة ، على التوالي ، كما هو موضح أدناه.

بمجرد ضبط المعلمات ، أغلق الفحص لمنع التعرض غير الضروري لليزر الذي قد يتسبب في السمية الضوئية والتبييض الضوئي للعينة. الآن ، حدد أيقونة متوسط الخط 2X ، والتي توفر أفضل جودة للصورة وأسرع وقت مسح ضوئي. حدد الفاصل الزمني والمدة الزمنية المناسبين اللازمين للتجربة.

بالنسبة للانقسامات الخلوية من النوع البري ، تكون الفواصل الزمنية لمدة دقيقتين لمدة ساعتين كافية لتحديد المدة الانقسامية. الأقسام التي تنشط نقطة تفتيش تجميع المغزل لمدة تزيد عن ثلاثين دقيقة هي أكثر ملاءمة لفترات تتراوح من أربع إلى خمس دقائق لمدة أربع ساعات ، من أجل الحفاظ على فلورسينس ، كما هو موضح هنا. لحفظ الملف تلقائيا أثناء الحصول عليه، حدد المربع حفظ في ملف، وقم بتسمية الملف.

أخيرا ، تحقق جيدا من تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح ، واضغط على تشغيل الآن. بعد اكتمال الاستحواذ ، لعرض الملف بتنسيق ثلاثي الأبعاد ، انقر فوق أيقونة عتبة الحجم. يوضح هذا الشكل القدرة على مراقبة العديد من انقسامات الخلايا باستخدام مجال رؤية واسع لذيل الزرد البري من النوع AB.

يشار إلى انقسامات الخلايا بعلامات النجوم. يتم عرض الفيلم المقابل هنا. في المتوسط ، لوحظ وجود 50 خلية منقسمة في AB ، و 30 خلية منقسمة في طفرة الشفق القطبي B.

لحساب العدد المنخفض للخلايا الانقسامية التي تم تصويرها في الجنين المتحور الشفق القطبي B ، تم حساب نسبة الخلايا الانقسامية إلى عدد الخلايا المصورة ، مما يشير إلى أنه لا يوجد عدد أقل من الخلايا التي تمر عبر الانقسام في الأجنة الطافرة الشفق القطبي B ، ولكن بدلا من ذلك ، عدد أقل من إجمالي الخلايا التي يتم تصويرها. لتحديد المدة الانقسامية ، يتم ضرب عدد الفترات الزمنية التي تشغل انقساما واحدا للخلية في الفاصل الزمني بين كل مكدس Z. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، فإن متوسط وقت الانقسام من النوع البري AB هو 25 دقيقة ، و 58 دقيقة لمتحور الشفق القطبي B.

كما هو موضح في الأجنة البرية ، يمكن تمييز كل مرحلة انقسامية. ومع ذلك ، لوحظت عيوب انقسامية في الجنين المتحور الشفق القطبي B ، والتي تشمل التوقف الانقسامي والحركية الخلوية ، مما يؤدي إلى خلية ثنائية النواة ، وتكوين لاحق للنوى الدقيقة ، والتي تدعم زيادة وقت الانقسام المقاس في هذا الطفر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ساعة واحدة ، من فحص الأجنة إلى إعداد معلمات المجهر متحد البؤر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر سياق التجربة المطروحة ، من حيث صلتها بمنطقة الاهتمام ، والمدة الزمنية ، والفاصل الزمني ، وعمق Z. سيساعد ذلك على زيادة الكفاءة إلى أقصى حد ، وكذلك منع التبييض الضوئي والسمية الضوئية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل انتشار الكروموسوم ، للإجابة على أسئلة إضافية حول سبب العيوب الانقسامية التي لوحظت ، أو استخدام علاج دوائي لتحديد التأثيرات على تطور الانقسامات أو مدتها أو مصير الخلية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء لاستكشاف الانقسام في سياق بيولوجيا النمو والسرطان باستخدام سمك الزرد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تضمين أجنة الزرد ، والتقاط صور حية للانقسام ، وتحليل التردد الانقسامي ، والمدة ، ومصير الخلية. لا تنس أن العمل باستخدام الليزر عالي الطاقة وضوء الفلورسنت يمكن أن يضر بالعينين ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل تجنب الاتصال المباشر بالعين مع الليزر ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.