عزل خلايا Mesangiogenic السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) من نخاع العظام البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا السلفية المتوسطة أو MPC من نخاع العظم البشري عن طريق ظروف الثقافة الانتقائية. نحن نختبر كل من إمكاناتها المتوسطة والأوعية الدموية. يتم تحديد الخلايا السلفية الوسيطة بنسبة منخفضة من خلال ثقافة خلايا mesen-ki-ma-stro-mo المحسنة للتطبيق السريري.

عندما يتم استبدال FBS بمصل بشري. هذه التقنية فريدة من نوعها ، في الواقع ، فهي تسمح بعزل ثابت للغاية لعدد كبير من الشخصيات غير القابلة للعب ، والمناسبة لتكوين الأوعية الدموية وجيل من ثقافات MSC المتزامنة. اكتشفنا هذا عندما بعد رحلات في هضم مزارع MCS في مصل التلغرام ، لا يزال عدد قليل من الخلايا على شكل بيضة مقلية مرتبطة ولكن يتم تمايزها إلى MCs بعد علاج FPS.

لعزل الخلايا أحادية النواة لنخاع العظم البشري ، ابدأ بتخفيف خمسة إلى 10 ملليلتر من نخاع العظم الطازج حتى الحجم الإجمالي 50 مل باستخدام DPBS وخلط محلول الخلية عن طريق الانعكاس. بعد ذلك ، قم بتوزيع 25 مل من الخلايا بالتساوي في أنبوبين مخروطيين جديدين سعة 50 مليلتر وأضف 25 مل من DPBS الطازج إلى كل أنبوب لمزيج ثان عن طريق الانعكاس. ثم ضع الخلايا في درجة حرارة الغرفة للسماح لشظايا العظام المعدنية والدهون بالانفصال عن المحلول.

بعد 10 دقائق ، استخدم ماصة باستور لإزالة الدهون العائمة بعناية وتصفية معلقات الخلية من خلال مرشحات فردية 70 ميكرون دون إزعاج حبيبات شظايا العظام المعدنية. لعزل طبقة MNC 20-25 مل من نخاع العظم المخفف فوق درجة حرارة الغرفة 1.007 جرام لكل مليلتر كثافة وسط تدرج في كل من أنبوبين 50 ملليلتر وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم استخدم ماصة معقمة لتجميع حلقات الخلايا البيضاء عند الوجوه المدخلة في أنبوب جديد سعة 50 مل.

اغسل الخلايا أحادية النواة المعزولة بوسط زراعة طازج لمدة خمس دقائق عند 400 ضعف درجة الحرارة ودرجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الحبيبات في خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج. لعزل MPC موازنة قوارير T75 الكارهة للماء مع 15 مل من وسط الاستزراع الطازج عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

بعد 30 دقيقة ، قم بزرع أربعة إلى ستة مرات 10 إلى سبعة من الخلايا أحادية النواة لنخاع العظم البشري لكل قارورة لمدة 48 ساعة. في اليوم الثاني ، تخلص من الخلايا المتوسطة وغير الملتصقة من القوارير وقم بتغذية الخلايا ب 15 مل من وسط الثقافة الطازجة. أعد المزارع إلى الحاضنة لمدة ستة إلى ثمانية أيام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا الملتصقة ب DMEM الطازج. ثم احتضان الخلايا بملليلترين من محلول فصل البروتيز الخالي من لمدة خمس إلى 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عندما ترفع الخلايا من قاع القارورة ، أضف 10 مل من وسط الثقافة الطازجة لإيقاف التفاعل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق الحبيبات في واحد إلى ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة.

بعد عد لوحة MPC مرتين في 10 إلى أربعة في السنتيمتر المربع من الخلايا في قوارير ثقافة T75 المعالجة وتلتصق بالخلايا طوال الليل في 15 مل من وسط الثقافة الطازجة في حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، استبدل الوسط المزروع ب 200 ميكرو لتر لكل سنتيمتر مربع من خلية misancolmulstromul أو وسيط تمدد MSC وزرع الخلايا لمدة سبعة إلى 10 أيام أخرى. عندما تصل الثقافات إلى التقاء الزراعة الفرعية عند ثلاثة إلى خمسة في عشرة إلى ثلاث خلايا لكل سنتيمتر مربع حتى تصل إلى التقاء جديد من الممر الثاني في MSC ، قم بإجراء هضم البروتيز لجمع الخلايا كما هو موضح سابقا.

صفيحة اثنان في عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في ثقافة الأنسجة عالجت ستة لوحات جيدة ووسط تمدد طازج. بعد زراعة الثقافات إلى التقاء مرة أخرى ، ضع علامة على بئرين على أنهما لا يوجد تمايز وقم بتحديث وسط التمدد. ضع علامة على بئرين كانفجارات عظمية واستبدل الوسط ب 200 لتر ميكرو لكل سنتيمتر مربع من وسط العظم الجيني القياسي المصمم خصيصا لتمايز MSC.

ثم ضع علامة على بئرين كمواقع adipo واستبدل الوسط ب 200 ميكرو لتر لكل سنتيمتر مربع من وسط adipo الجيني القياسي المصمم خصيصا للتمايز MSC. أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع حتى تتمايز الخلايا. ثم انتقل إلى الكشف عن الفلورسنت لرواسب الكالسيوم الخلوية الإضافية وتراكم قطرات الدهون الخلوية الداخلية.

لإنتاج كرويات ثلاثية الأبعاد ، قم بزرع عدد كبير من قطرات 20 لترا صغيرا من معلق MPC المعزول حديثا على السطح الداخلي لغطاء طبق بتري. عندما يتم وضع جميع القطرات ، ضع الغطاء بحذر على قاعدة طبق بتري تحتوي على DPBS لمنع التبخر المعلق ، ووضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، أضف 300 ميكرو لتر من بروتينات المصفوفة الخلوية الإضافية القياسية إلى كل بئر بأربع درجات مئوية 24 لوحة ثقافة بئر وهلام بروتينات المصفوفة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أضف 700 لتر ميكرو من وسط نمو الخلايا الداخلية القياسية الغنية بعامل نمو الأوعية الدموية إلى بروتينات ECM المتبلورة. عندما تتجمع MPC في كبوتيات ثلاثية الأبعاد ، اقلب غطاء طبق بتري بعناية واستخدم ماصة باستور معقمة لحصاد الكرات برفق. أخيرا ، قم بزرع الكرويات في آبار الثقافة وأعد اللوحة إلى الحاضنة.

من الناحية المورفيتولوجية ، تتميز MPC بشكلها المميز للبيض المقلي مع منطقة أساسية سميكة محاطة بمحيط مسطح ورفيع يعرض العديد من الفيليبوديا. غالبا ما يلاحظ الاستطالة القطبية لحدود الخلية الخارجية. تؤدي ثقافة MPC في وسط تمدد MSC إلى تمايز سريع ولكن جزئي إلى خلايا مسطحة ومتعددة الفروع متكاثرة مع بقاء MPC غير متمايز لا يزال قابلا للاكتشاف.

بعد مرور آخر ، ينتج عن الثقافات طبقة أحادية من الخلايا الجذعية الجذعية التي تنمو بشكل كبير. في هذه العملية ، تعيد MPC تنظيم F-Actin إلى ألياف إجهاد بينما يقتصر تعبير Nestin على عدد قليل من الخلايا النادرة. يظهر تدفق تدفق MPC المعزول حديثا أكثر من 95٪ من الخلايا التي تعبر عن CD31 و CD45 ولكنها تفتقر إلى المستضدات المرتبطة ب mis-en-com-al CD90 و CD 73.

يتم التعبير عن هذه المستضدات الحديثة بشكل كبير فقط بعد التمايز الكامل إلى MSC. تأكيدا لطبيعتها الخاطئة عند تغذيتها بوسط ممايز لمدة أسبوعين على الأقل ، يمكن بسهولة تحفيز هذه الخلايا في انفجارات العظم كما يتضح من رواسب الكالسيوم أو الدهون كما يتضح من تراكم قطرات الدهون. تأكيد طبيعة MSC لمزارع الخلايا المتمايزة مسبقا.

تم تأكيد كتابة MPC بشكل أكبر في اختبار تكوين الأوعية الدموية المنبت حيث تظهر الخلايا القدرة على غزو هلام بروتين مصفوفة خلوية إضافية من الكرويات ثلاثية الأبعاد بعد 24 ساعة من تحفيز عامل نمو بطانة الأوعية الدموية. بعد أسبوع واحد ، تهاجر الخلايا الغازية على مسافة أكبر ، وهي قدرة غزو تضيع في الممر الثاني MSCs بعد التمايز الوسيط. بمجرد إتقان ثقافات MSC ، يمكن إنشاء ثقافات MSC في ساعة واحدة إذا تم التعامل مع ذلك بشكل صحيح ، مما يوفر ما بين مليون أو مليوني MPC أقل من أسبوع.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقييم أداء دفعات CR البشرية قبل استخدامها في الثقافة. في الوقت الحالي ، بروتوكول عزل MPC الخاص بنا هو الوحيد للحصول على ثقافة MC عالية القابلية للتكرار بالقرب من نقية لمزيد من التطبيقات النهائية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال العلاجات القائمة على الخلايا لاستكشاف إمكانية تطبيق MPC في تجديد الأنسجة الهيكلية.