كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

الهدف العام من هذا النموذج هو التحقيق في كيف يمكن لصلابة الغشاء القاعدي وسمكها ، بسبب الجلوك المتقدم والتعرض للمنتج أن يعدل سلوك الخلية الغازية المقابل للمراحل المبكرة والمتقدمة من سرطان البروستاتا النقيلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المتعلقة بالعمر. مثل كيف تساهم زيادة صلابة الغشاء القاعدي وسمكها في تطور السرطان ، وكذلك اضطرابات التمثيل الغذائي مثل مرض السكري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة بسيطة لتقليد مستوى الصلابة المقاسة في أورام البروستاتا البشرية في البيئة السريرية. يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاجنا وتشخيص سرطان البروستاتا من خلال تحسين فهمنا لكيفية تعزيز تصلب الغشاء القاعدي للتغيرات الجزيئية والخلوية. قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأن النموذج متعدد التخصصات.

الجمع بين التقنيات في مجالات الكيمياء والفيزياء والأحياء. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما افترضنا أن تصلب الغشاء القاعدي في غدة البروستاتا يمكن أن يعزز السلوك الغازي من جديد في الخلايا الظهارية المحولة المعروفة. يعد عرض الفيديو لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، لأنه يجب وصف الخطوات متعددة التخصصات.

بما في ذلك الربط المتقاطع للغشاء القاعدي ، متبوعا بثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. ابدأ بتحضير سطح مستو من الثلج ، واستخدمه لتبريد شريحة زجاجية مكونة من ثمانية غرف آبار إلى أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اقطع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتبريد الطرف إلى أربع درجات مئوية أيضا.

بمجرد أن يبرد ، ضع الطرف على مساعد سحب العينات بسعة 200 ميكرولتر. واستخدمه لنقل 40 ميكرولترا من محلول مصفوفة BM المثلج إلى كل بئر من الشريحة الزجاجية المبردة ذات الثمانية غرف آبار. ثم ضع شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز بلمرة الغشاء القاعدي.

أغلق باب الحاضنة بعناية فائقة لتجنب إزعاج الغشاء القاعدي المعاد تشكيله السائل. بعد 30 دقيقة بالضبط ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الجليكول ألدهيد المحضر لتغطية الغشاء القاعدي المبلمر والمعاد تشكيله. بعد ذلك ، قم بإعداد عنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة 250 ميركولتر من PDS المعقم إلى هلام غشاء القاعدي الأصلي المعاد تشكيله.

أيضا ، قم بإعداد ضابطين إضافيين عن طريق إضافة 50 مللي مولار سيانوبوروهيدريد الصوديوم ، أو 250 مللي مولار أمينوجوانيدين إلى محلول الجليكولالديهايد قبل إضافته إلى هلام الغشاء القاعدي. بعد ذلك ، احتضن المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات لإنتاج هلام شبه صلب. أو لمدة 14 ساعة لإنتاج هلام صلب.

بعد الحضانة ، قم بإزالة المحاليل بعناية من المواد الهلامية وأضف 250 ميكرولتر من إستر إيثيل جلايسين مولار واحد إلى كل هلام. واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل كل جل 10 مرات في 500 ميركولتر من PBS لإزالة جميع آثار محلول الجليكولالديهايد وإستر إيثيل الجلايسين.

ثم أضف 400 ميكرولتر من PBS لمنع الجفاف واحتضان المواد الهلامية الغشائية القاعدية المعاد تشكيلها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا للمتابعة ، قم بإزالة PBS من المواد الهلامية الغشائية القاعدية المعاد تكوينها ، وأضف 250 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج المثلج إلى كل بئر. احتضان المواد الهلامية عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة للتأكد من أن المصفوفة سائلة تماما.

ثم انقل الغشاء القاعدي المسال إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بقياس انبعاث الفلورسنت للمحلول باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ثم الطرد المركزي المحلول وإزالة المادة الطافية الناتجة. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على 20 ملليغرام لكل مليلتر بروميد السيانوجين و 70٪ حمض الفورميك.

احتضان العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم حقنة يمكن التخلص منها سعة مليلتر واحد لنقل هلام الغشاء القاعدي المعاد تعليقه إلى شريط غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي يبلغ 3.5 كيلو دالتون. اغمر الكاسيت في دورق زجاجي سعة 500 مل يحتوي على 500 مل من الماء المقطر المزدوج.

وحرك الماء بشريط تحريك مغناطيسي. ضع هذا الإعداد طوال الليل عند أربع درجات مئوية لإزالة جميع آثار بروميد السيانوجين وحمض الفورميك. استخدم حقنة يمكن التخلص منها سعة مليلتر واحد لنقل المحلول المطلوب من الكاسيت إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ثم قم بتحليل المحلول عن طريق تشغيله على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 12٪. قم بتلطيخ الجل بصبغة الفضة لتصور النمط الكهربائي لببتيدات مصفوفة بروميد السيانوجين. بدءا من المواد الهلامية الغشائية القاعدية المغطاة ب PBS ، اشطف المواد الهلامية مرتين إضافيتين ، مع 300 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1 ملليمول من كلوريد الكالسيوم.

و 0.5 ملليمول من كلوريد المغنيسيوم. لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS وأضف 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد لتغطية كل هلام غشاء القاعدي المعاد تشكيله.

احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح مكونات الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت وأضف 300 ميكرولتر من محلول التبريد الذي يحتوي على 75 ملليمول من كلوريد الأمونيوم و 0.5 ملليمول من كلوريد المغنيسيوم. احتضن المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة المحلول وكرر الشطف أربع مرات أخرى.

بعد الشطف النهائي ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتألق المناعي إلى المواد الهلامية الغشائية القاعدية المعاد تكوينها لمنع التفاعلات غير المحددة. احتضان المواد الهلامية في المحلول لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على منصة اهتزاز. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت الذي يحجب التألق المناعي.

وأضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المخفف في المخزن المؤقت للحظر. احتضان المواد الهلامية الغشائية القاعدية المعاد تكوينها عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل المواد الهلامية ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول التألق المناعي.

رج المواد الهلامية في درجة حرارة الغرفة على منصة اهتزاز لمدة 10 دقائق بعد كل إضافة عازلة. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت وأضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى باللون الفلوري ، المخفف في المخزن المؤقت للحظر. ضع العينات على منصة اهتزاز ، واحتضن المواد الهلامية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي. اشطف العينة في مخزن مؤقت للتألق المناعي ، متبوعا ب PBS ، ثم قم بإصلاح العينات وإخمادها مرة ثانية. أخيرا ، قم بتركيب المواد الهلامية واستخدم مجهرا لتحليل تكوين حزم كثيفة.

لتشكيل أسيني غدة البروستاتا ، قم بتخفيف 5 ، 000 خلية RWPE-1 في 300 ميكرولتر من KSFM الكامل ، مع استكمال 2٪ من محلول الغشاء القاعدي. بالنسبة لمجاميع خلايا ورم البروستاتا ، قم بتخفيف 2 ، 500 خلية PC3 في 300 ميكرولتر من وسط زراعة RPMI-1640 ، مع استكمال 2٪ من محلول الغشاء القاعدي. بعد الحضانة الليلية للمواد الهلامية الغشائية القاعدية المعاد تكوينها في PBS ، اشطفها مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع.

قبل بذر الخلايا. قم بزرع الخلايا برفق على الأغشية القاعدية المعاد تشكيلها الأصلية والمتقدمة للمنتج النهائي. ووضع الثقافات بعناية في حاضنة لضمان التوزيع المتساوي للأسيني والكروبيات المتنامية.

بالنسبة للخلايا المكونة للأسيني ، قم بتغيير الوسط كل يومين بوسط استزراع طازج يحتوي على 2٪ من محلول الغشاء القاعدي. للتأكد من أن الخلايا لديها عوامل النمو المطلوبة لتوازن أسيني الطبيعي. بعد ستة أيام في المزرعة ، تشكل الخلايا الظهارية للبروستاتا أسيني على الغشاء القاعدي الأصلي المعاد تشكيله.

ويتم تنظيمها في كرويات موحدة من الخلايا الظهارية. تتميز هذه الأسيني أيضا بخصائص PECs عالية التنظيم مع قطبية قمية إلى قاعدية ، ومساحة لمعية مرئية. عند زراعتها لمدة ستة أيام على الغشاء المتصلب ، يكون للخلايا بنية مضطربة.

والتغيير من كروي إلى متعدد الأضلاع في الشكل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه الأسيني غير منظمة للغاية. وفقدوا قميتهم إلى قطبية قاعدية ، مع مساحة لمعية صغيرة أو غير موجودة.

هذا ينطبق أيضا على الخلايا المشتقة من غدة البروستاتا المصابة بتضخم البروستاتا الحميد. عندما تم قياس خلايا ورم البروستاتا ، وجد أن الخلايا أطول على الغشاء القاعدي المتصلب والمعاد تشكيله ، كما أنها هاجرت بشكل أسرع وزادت من ثبات الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمذجة تأثيرات تصلب الغشاء القاعدي على سلوك الخلايا الظهارية والسرطانية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المستوى المطلوب من صلابة الغشاء القاعدي يتم إحداثه ، ويتم تشكيل الأسيني الفردي أو الكرويات الفردية بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأورام لاستكشاف تحريض غزو الخلايا السرطانية عن طريق تصلب الغشاء القاعدي في غدة البروستاتا. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء طريقة أخرى ، مثل النشاف المناعي لمحاللة الخلايا للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بمسار الإشارات ، معدلة بواسطة صلابة الغشاء القاعدي.

لا تنس أن العمل مع سيانوبوروهيدريد الصوديوم وبروميد السيانوجين وحمض الفورميك يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات وواقي الوجه وجهاز التنفس الصناعي أثناء العمل في غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.