تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

تنقية الحمض النووي الدائري خارج الكروموسومي من الخلايا حقيقية النواة على نطاق الجينوم كاملاً. مرحبًا، أنا راسموس. سأقوم هنا بعرض المخطط العام لطريقة تنقية الحمض النووي الدائري.

في الجزء الأول، يتم استزراع خلايا الخميرة وحصدها. بعد ذلك، يتم تنقية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الدائري وتضخيمه في ثلاث خطوات. أولاً، من خلال الفصل باستخدام العمود حيث يتم تنقية جزيئات DNA الدائرية وإثراؤها.

ثم، من خلال معالجة DNA بإنزيم exonuclease لهضم جميع سلاسل DNA الخطية المتبقية، وأخيراً عن طريق تضخيم حلقات DNA باستخدام polymerase phi-29. وفي الجزء الخامس من هذا البروتوكول، يتم تسلسل حلقات DNA وتعيين القراءات إلى الجينوم المرجعي لـ Saccharomyces cerevisiae. وفي نهاية هذا الفيديو، سنعرض لكم بعض النتائج النموذجية.

سنناقش آفاق الدراسات المستقبلية ومزايا استخدام هذه الطريقة. الجزء الأول، حصاد الخلايا. يتم تنمية المزرعة البادئة عند 30 درجة مئوية مع التقليب للوصول إلى أقصى كثافة، والتي تبلغ حوالي 200 million cells per milliliter ويتم الوصول إليها بعد 24 إلى 48 ساعة.

يُنقل المزرعة النامية إلى أنبوب Falcon ويتم ترسيبها عن طريق الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق. يُزال الطافي، ثم يُرجّ الراسب الكبير باستخدام جهاز vortex في محلول TE المنظم ويُعاد ترسيبه بواسطة الطرد المركزي.

الجزء الثاني، التنقية باستخدام العمود. في هذه الخطوة، نستخدم طقم تنقية بالأعمدة متاحاً تجارياً يتيح الحصول على بلازميدات عالية النقاء من الحمض النووي الجينومي البكتيري. وقبل استخدام هذا الطقم مع الخميرة، يجب تكسير الجدار الخلوي.

يتم ذلك عن طريق إعادة تعليق كتلة الخلايا المغسولة في Buffer L-1 الموجود في الطقم. تُنقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وتُضاف حبيبات زجاجية بما يعادل ثلث الحجم الإجمالي. يتم خلط العينة باستخدام جهاز vortex بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق، ثم تُزال الحبيبات عن طريق الطرد المركزي بسرعة 2,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.

يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. وفي هذه الطريقة، نضيف بلازميدات مخففة للغاية إلى السائل الطافي بنسب ثلاث مختلفة. ونقترح إدراج البلازميد المخفف للغاية في الدورة.

يمكن أن يعمل هذا كأدلة مرجعية داخلية. يمكنك استخدام ذلك للتحقق من جودة تنقية DNA وتضخيمه، كما يمكنك إجراء تقدير شبه كمي لـ DNAs غير الدائرية لكل خلية باستخدام هذه البلازميدات المضافة (spike in plasmids). يجب إضافة البلازميدات المخففة للغاية فقط، لأنها قد تؤثر على دقة تحليل تسلسل الـ DNAs الدائرية الأخرى.

تُعالج معلق الخلايا التي تحتوي على البلازميدات المضافة بمحلول L-2 من الطقم، ثم يُتبع بروتوكول الطقم. وبعد تحميل العمود، يتم إزالة البروتينات والدهون والحمض النووي الكروموسومي عن طريق غسل العمود مرتين. ويتم إثراء الحمض النووي الدائري خارج الكروموسومي بشكل كبير في جزء الاستخلاص.

الجزء الثالث، هضم الحمض النووي DNA الخطي. في هذه الخطوة، نستخدم إنزيم exonuclease لهضم ما تبقى من الحمض النووي DNA الخطي. يستهدف إنزيم exonuclease المعتمد على ATP بشكل محدد الحمض النووي DNA الخطي مزدوج السلسلة وأحادي السلسلة دون هضم الحمض النووي DNA الدائري.

تم التأكد من خصوصية الإنزيم الهاضم للنهايات (exonuclease) للحمض النووي DNA الخطي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام بعد 29 ساعة من المعالجة بإنزيم DNase. وتظهر النتائج أن الحمض النووي DNA الجينومي قد تم هضمه بينما ظل الحمض النووي DNA البلازميدي سليمًا كما يشير السهم الأحمر. تحتوي الخميرة على 16 كروموسومًا، يصل طول بعضها إلى 1,500 kilobases.

ولتسهيل عملية الهضم بواسطة الإكسونوكلياز، يتم استخدام إنزيم قطع داخلي (endonuclease) نادر للحصول على عدد أكبر من نهايات DNA التي يمكن الوصول إليها. في حالة استخدام إنزيم التقييد NotI، يتم قطع كل كروموسوم ما يصل إلى سبع مرات كما هو موضح. يتمت معالجة DNA المنقى بالعمود باستخدام NotI عند 37 درجة في كتلة تسخين طوال الليل.

بعد التثبيط الحراري لإنزيم NotI، يتم معالجة الحمض النووي المقطوع باستخدام إنزيمات exonucleases عند 37 درجة مئوية وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وبعد المعالجة بإنزيمات exonuclease، يتم تثبيط الإنزيمات حرارياً عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قد يستغرق هضم جميع الحمض النووي الكروموسومي الخطي عدة أيام بإضافة ATP وإنزيم exonuclease إضافي. ولضمان هضم جميع الحمض النووي الخطي تماماً، يتم تحليل العينات بطرق PCR أو qPCR باستخدام جين مرجعي داخلي مثل ACTI.

الجزء الرابع، تضخيم الحمض النووي DNA. في هذه الخطوة، نقوم بإثراء وتضخيم الحمض النووي DNA الدائري باستخدام بوليميراز phi-29. يتم التفاعل عند 30 °C باستخدام قليلات النوكليوتيد السداسية العشوائية وphi-29.

تتميز البوليميراز بدقة عالية ونشاط تدقيق لغوي، مما يضمن تضخيماً غير منحاز للحمض النووي DNA. ويمكن لكل بوليميراز، من خلال تضاعف الدائرة المتدحرجة، تخليق ما يصل إلى 100 kilobases من الـ DNA. كما أن البوليميراز يتميز بقدرة معالجة عالية، حيث يضخم الـ DNA بمقدار يصل إلى 10⁹ ضعفاً.

الجزء الخامس، التسلسل. باتباع البروتوكول الخاص بمنصة تسلسل الجيل التالي عالية الإنتاجية، يتم تعريض DNA للموجات فوق الصوتية للوصول إلى متوسط حجم يبلغ 300 base pairs، ثم يتم تسلسله على شكل قراءات أحادية الطرف بطول 141 nucleotide. تُطابق قراءات التسلسل مع الجينوم المرجعي لـ Saccharomyces cerevisiae، باستخدام قاعدة بيانات Galaxy المجانية.

يتم رفع البيانات المتسلسلة إلى منصة Galaxy وتعيين القراءات باستخدام أداة محاذاة القراءات القصيرة Bowtie2، التي تسمح بتعيين القراءات الجزئية. الجزء السادس، النتائج التمثيلية. بعد التسلسل والتعيين إلى الجينوم المرجعي لـ Saccharomyces cerevisiae، يمكن تصور القراءات في متصفح الجينوم داخل برنامج Galaxy.

يمكن، على سبيل المثال، حساب الحمض النووي DNA ذي الأصل الدائري كالمناطق التي تحتوي على قراءات متسقة تزيد عن kilobase واحد كما هو موضح على الشاشة. ومن الأمثلة على منطقة في الكروموسوم الرابع تحتوي على قراءات متسقة تمتد لأكثر من kilobase واحد هي المنطقة التي تضم جينات ناقل الهكسوز six وseven. عند استخدام هذه الطريقة على مجموعة من خلايا الخميرة، غالباً ما يتم العثور على قراءات مُحددة في هذا الموقع، ويشير تغطية القراءات بوضوح إلى أن دائرة DNA قد تشكلت بين جينات ناقل الهكسوز المتوازية (paralog).

نظرًا لوجود تماثل تسلسلي عالٍ بين جينات ناقل الهكسوز، فإننا نفترض أن إعادة التركيب المتماثل غير المشروع تؤدي إلى تحويل هذا الحمض النووي DNA إلى شكل دائري. وتحدث طفرة الحمض النووي DNA الدائري في هذا النموذج عندما تتم عملية إصلاح الحمض النووي DNA بشكل غير مكتمل. فعلى سبيل المثال، إذا حدث كسر في الشريط المزدوج ضمن عنصر متكرر، يمكن حينئذٍ استخدام التسلسل المتماثل الموجود على نفس الكروماتيد كقالب لإصلاح الحمض النووي DNA عن طريق إعادة التركيب المتماثل.

بعد عملية الاستئصال، وغزو السلسلة، وتصنيع DNA، وحل جميع التفرعات، يمكن حينئذٍ أن تلتف حلقة DNA من الجينوم مما يتسبب في حدوث حذف لـ DNA على الكروموسوم. ويمكن تصور تأثيرات معالجة DNA باستخدام الإنزيمات الهاضمة للنواة (exonucleases) وبوليميراز phi-29 باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم. تظهر ضوابط الصبغ لـ DNA الجينومي كما في الصورة اليسرى، بينما يظهر DNA البلازميدي كما في الصورة اليمنى.

بعد 29 ساعة من المعالجة بإنزيم exonuclease لـ 400 nanograms من DNA الجينومي، يتم هضم معظم الـ DNA كما هو موضح في الصورة اليسرى. وتتأكد هذه النتيجة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام كما يظهر في صورة الهلام على اليمين. وبعد 72 ساعة من المعالجة بإنزيم exonuclease متبوعة بتخليق DA بواسطة بوليميراز phi-29، لا يزال من الممكن تحديد ملايين النسخ من DNA.

وبالمثل، بعد معالجة 400 نانوغرام من DNA الجينومي بإنزيم الإكسونوكلياز لمدة 29 ساعة، بالإضافة إلى 100 نانوغرام إضافية من DNA البلازميد، يتم هضم معظم DNA الجينومي. ومع ذلك، لا يتم هضم DNA البلازميد كما يتضح من صورة الهلام. وبعد معالجة العينة التي عولجت بالإكسونوكلياز لمدة 72 ساعة باستخدام بوليميراز phi-29، يظهر معظم DNA المضخم على شكل بلازميدات مصبوغة.

لذا، قمنا أولاً بفحص الجينات بحثاً عن الحمض النووي الدائري، وقد فوجئنا حقاً بالعثور على عدة مئات من الأنواع المختلفة من عينات الحمض النووي. نعم، لقد كان من المفاجئ حقاً اكتشاف مدى شيوع دوائر الحمض النووي في مجتمع الخميرة، ونعتقد أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في العديد من أنواع الدراسات، ومن الواضح أن إحداها ستكون دراسة الأنسجة البشرية.

نعلم أنه يمكن تضخيم الجينات على عناصر دائرية وفي الخميرة بالطبع، وحتى في الخلايا الورمية. أعتقد أنه سيكون من المثير للاهتمام بشكل عام فحص الخلايا الجسدية والبحث في نوع الحمض النووي الدائري الذي سنجده هناك وكيف يمكن أن يحدث هذا التأثير. التدوير. ففي الخلايا الهرمة، لدينا دوائر تتراكم مع تقدمنا في السن، ونتوقع العثور على المزيد من الجينات على الحمض النووي الدائري.

بالإضافة إلى ذلك، نود دراسة الآليات الجزيئية لعملية دائرية DNA، ومن البديهي القيام بذلك من خلال دراسة الخميرة حيث تتوفر لدينا طفرات تعاني من خلل في إعادة الاندماج المتماثل وإعادة الاندماج غير المتماثل. ومن خلال دراسة هذه الطفرات، نتوقع أن يختلف ملف دائرية DNA باختلاف أنواع الطفرات، ونأمل من خلال دراسات الخميرة أن نتمكن من معرفة المزيد عن عملية دائرية DNA. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية بكثير، حيث قد نتمكن فعلياً من العثور على DNA دائري في خلية واحدة تقريباً من بين كل 10,000 خلية.

وبناءً على ما أعرفه من الدراسات والتحارب التي أجريت باستفاضة، فإن الأليلات الطافرة عادةً ما يجب أن تصل نسبتها إلى ما بين 1% إلى 10% من المجتمع الخلوي قبل أن يصبح من الممكن اكتشافها. صحيح، ومن خلال هذه التقنية، لا يتعين عليك امتلاك معرفة مسبقة بدوائر DNA المتكونة، على عكس التقنيات الأخرى التي تتطلب أن تكون دوائر DNA مرتبطة بشكل ما، ومن ثم يمكنك اكتشافها بسهولة كعمليات تضخيم عن طريق التسلسل أو عن طريق صبغ الكروموسومات.

نعم، أعتقد أن الميزة الرئيسية تكمن في الحساسية، وآمل أن نتمكن من القيام بالعديد من الأشياء المثيرة للاهتمام باستخدام هذه الطريقة.