استخدام البطارية من الطرق الكيميائية والسمية الإيكولوجية لتقييم فاعلية عمليات معالجة مياه الصرف الصحي لإزالة استروجين الفعالية

الهدف العام من مجموعة الاختبارات الموضحة هنا، والتي تشمل الكيمياء التحليلية وطرق المختبر (in vitro) والطرق الحيوية (in vivo)، هو تحديد مدى فعالية تقنيات معالجة مياه الصرف الصحي الناشئة والمبتكرة في إزالة الملوثات الاستروجينية. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الهندسة البيئية، على سبيل المثال، عند اختيار أكثر عمليات معالجة مياه الصرف الصحي فعالية في تقليل القوة الاستروجينية لمياه الصرف. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنيات في أنها حساسة للتراكيز المنخفضة جداً من المركبات النشطة، مما يثبت أفضل التقنيات لحماية الحياة المائية.

سيقوم بتوضيح الإجراءات كل من زميل ما بعد الدكتوراه، د. Chris Green، وطالبة الدراسات العليا، Angela Pinzon، وزميلة الأبحاث، د. Alice Baynes، وكبيرة فنيي الأبحاث، Nicola Beresford. تتطلب عملية SPE اهتماماً دقيقاً بالنظافة والترتيب لمنع تلوث العينات. قم بتنظيف جميع الأنابيب والصنابير والأقراص الخزفية مسبقاً باستخدام methanol.

قبل تشغيل العينات، قم بتوصيل خطوط النقل بمجمّع الاستخلاص، واشطف النظام بأكمله باستخدام الماء منزوع الأيونات. ولتشغيل العينات، قم أولاً بتركيب بطانات الصمامات التي تستخدم لمرة واحدة، ثم ركب خراطيش SPE المكونة من الستيرين ثنائي فينيل بنزين. بعد ذلك، استخدم الماصة لنقل 5 mL من إيثيل الأسيتات إلى كل خزان لتهيئة الخراطيش.

خلال هذه الخطوة، تأكد من إحكام غلق SPE. بعد ذلك، قم بتشغيل مضخة التفريغ بمعدل تدفق قدره 10 millimeters per minute. وقبل أن تجف الخراطيش، قم بتحميل 5 milliliters من الميثانول، يليه 5 milliliters من الماء.

من المهم جداً ألا تجف خراطيش SPE. بعد سحب معظم المياه، أوقف تشغيل المضخة واملأ كل خزان خرطوشة بالماء. ثم، قم بتوصيل أنابيب PTFE بقطر 1/8 بوصة بين خزانات الخراطيش وزجاجات العينات الزجاجية.

الآن، قم بتحويل المكنسة الكهربائية إلى معدل تدفق أقل من 10 milliliters per minute، واسمح للعينة بأكملها بالمرور عبر الخرطوشة. بعد ذلك، جفف خراطيش SPE جيداً، حتى يتغير لون محتويات الخرطوشة. استخدم المكنسة الكهربائية أو تياراً غازياً.

الآن، ضع أنابيب تجميع زجاجية سعة 10 milliliter نظيفة وجافة في حامل، ثم ضع الحامل داخل مجمع الاستخلاص. تحقق من أن كل بطانة تقع فوق أنبوبة تجميع. املأ خزانات العينات بمرتين من 4 milliliter، ليصبح المجموع 8 milliliter من dichloromethane، ثم قم بتشغيل مضخة التفريغ، واترك السائل يمر عبر SPE وصولاً إلى أنابيب التجميع.

بعد ذلك، استخدم جهاز تركيز لتقليل الحجم في جميع أنابيب الجمع إلى 1 milliliter. انقل كل عينة إلى أنبوب جهاز أخذ العينات التلقائي (autosampler vial)، وقم بتركيزها بشكل أكبر لتصل إلى 100 µL، باستخدام جهاز تجفيف بالنيتروجين (nitrogen blow down equipment). وتتمثل المرحلة التالية في العملية في استخدام كروماتوجرافيا نفاذ الهلام (GPC) لإزالة التداخلات الجزيئية الكبيرة.

أولاً، يتم حقن 95 µL من مستخلص العينة المستخلصة في جهاز HPLC المجهز بـ GPC. يُركز مستخلص GPC حتى يصل إلى 200 µL باستخدام جهاز تركيز وجهاز نفخ النيتروجين، ثم يُكمل الحجم إلى 2 mL باستخدام الهكسان. بعد ذلك، يتم تركيب بطانات الصمامات المخصصة للاستخدام لمرة واحدة، وخراطيش amino purple، وخزانات الخراطيش في مجمع SPE، وعبر أنابيب تجميع زجاجية سعة 10 mL.

الآن، قم بتحميل 2 mL من الهكسان في كل خرطوشة لتهيئتها، ثم تخلص من المذيب. بعد ذلك، قم بتحميل مستخلص عينة GPC في الخزان، واسحبه عبر الخرطوشة. ضع مجموعة المستخلصات جانباً، واستبدل القارورة في الحامل لجمع ناتج الغسل.

بعد ذلك، مرر 2 mL من خليط إيثيل أسيتات والهكسان بتركيز 30% حجماً/حجماً عبر الخرطوشة. ثم أضف 2 mL إضافية من إيثيل أسيتات والهكسان، ثم تخلص من المحاليل الناتجة عن عملية الغسيل وأعد وعاء التجميع سعة 10 mL إلى الحامل. الآن، أضف 2 mL من خليط إيثيل أسيتات والأسيتون بتركيز 50% حجماً/حجماً في الخزان، وقم بتشغيل المضخة بمعدل تدفق منخفض، أقل من 2 mL/min.

بعد سحب السائل، أضف مليليترين آخرين من أسيتات الإيثيل بتركيز 50% إلى الخزان. الآن، استخدم جهاز تركيز لتقليل حجم المستخلص إلى 1 ملليلتر. بعد ذلك، انقل العينة إلى قارورة زجاجية أصغر، واستخدم جهاز التبخير بالنيتروجين لتبخير المستخلص حتى يبدأ في الجفاف. أضف 100 ميكرولتر من الميثانول، وامزج العينة جيداً ثم انقلها إلى قارورة جهاز أخذ العينات التلقائي المزودة بأنبوب إدخال سعة 0.3 ملليلتر.

بعد ذلك، قم بإجراء تحليل LC-MS/MS للمستخلص. وفي اليوم السابق لبدء المقايسة، قم بتحضير وسط نمو طازج، وقم بتلقيحه باستخدام قرص tenax الخاص بالسلالة المستخدمة من HER. وفي اليوم التالي، استعد للمقايسة عن طريق تحضير تخفيفات تسلسلية بحجم 100 µL من المواد الكيميائية المختبرة أو مستخلصات المياه العادمة، ثم تحضير منحنى قياسي لـ E2 في الإيثانول.

الآن، انقل حصصاً بمقدار 10 µL إلى طبق 96 بئراً معقماً ومسمى. بعد ذلك، اترك الطبق مكشوفاً لتبخير الإيثانول. ثم، قم بتحضير 50 mL من وسط النمو، مع إضافة 0.5 mL من محلول CPRG.

من مزرعة الخميرة التي استمرت لمدة 24 ساعة، قم بقياس العكر عند 620 نانومتر لتقدير كثافة الخلايا. بعد ذلك، أضف 40 مليون خلية خميرة إلى 50 ملليلتر من وسط المقايسة. انقل وسط المقايسة الملقح إلى حوض معقم، واستخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 200 ميكرولتر من الوسط إلى كل بئر في لوحة المقايسة.

أعد وضع غطاء طبق المقايسة، وأحكم إغلاق الحواف باستخدام الشريط اللاصق، ثم رج طبق المقايسة بقوة لمدة دقيقتين باستخدام هزاز الأطباق. بعد ذلك، قم بتحضين الطبق عند 32 Celsius، في خزانة تسخين جيدة التهوية. بعد ثلاثة أيام من التحضين، كرر عملية الرج مرة أخرى، ثم اترك الخميرة تترسب لمدة ساعة تقريبًا.

أخيراً، قم بقياس امتصاص الضوء للعينات عند 540 و620 نانومتر. تم تحليل عينات مياه من محطة تقليدية لمعالجة مياه الصرف الصحي لتنشيط عملية الحمأة فيها باستخدام تقنية LCMS بالرذاذ الإلكتروني للأيونات السالبة، وتبين وجود الإيثينيل إستراديول بتركيز أعلى من المستوى المتوقع لعدم حدوث تأثير. وباستخدام طرق معالجة المياه المتقدمة، مثل الكربون المنشط الحبيبي أو GAC، أمكن خفض مستويات الإيثينيل إستراديول بشكل كبير.

تم تحليل جميع مستخلصات مياه الصرف الصحي باستخدام معيار داخلي مُوسوم نظائرياً، وهو القمة الحمراء، للسماح بالقياس الكمي. كانت مقايسة فحص الخميرة للإستروجين حساسة بشكل واضح للإستراديول القياسي، ولكنها لم تظهر أي استجابة للإيثانول، والذي يمثل أساساً العينة الضابطة. كانت خلايا فحص الخميرة مستجيبة بوضوح لمياه الصرف الناتجة عن عملية الحمأة المنشطة، بينما أنتجت مياه الصرف المعالجة بالكربون المنشط الحبيبي (GAC) استجابة منخفضة، ومع ذلك ظلت أكثر نشاطاً بيولوجياً من العينة الضابطة.

باستخدام تقنية معالجة مياه الصرف الصحي المبتكرة هذه، انخفض كل من تركيز الإيثانول إستراديول، الموضح باللون الأزرق، والنشاط الإستروجيني، الموضح باللون الأخضر، بشكل ملحوظ من خلال المعالجة المشتركة ببيروكسيد الهيدروجين وTAML. وتعد محطات معالجة مياه الصرف الصحي المصدر الرئيسي لتلوث المياه السطحية بالمواد الإستروجينية. لذا، فإن إيجاد طرق جديدة لعمليات معالجة المياه لتحسين هذه التدفقات يتطلب اختباراً معمقاً للنشاط الإستروجيني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لمجموعة من الاختبارات الكيميائية واختبارات السموم البيئية اللازمة لقياس النشاط الإستروجيني في عينات المياه. من الأهمية بمكان ضمان تقليل تلوث العينات والمستخلصات إلى أدنى حد من خلال التعامل الدقيق معها. فعلى سبيل المثال، تحتوي المواد البلاستيكية شائعة الاستخدام على مركبات إستروجينية، لذا فمن الضروري تضمين ضوابط سلبية للتحقق من التلوث الكيميائي، وضوابط إيجابية للتأكد من نجاح طريقة الاستخلاص ومن تحقيق استرداد جيد للإستروجينات المضافة.