ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين توافر الخلايا الوحيدة (monocytes) وتقليل التباين في كثافة الخلايا التي يتم الحصول عليها أثناء تمايز الخلايا الوحيدة في الدم البشري إلى خلايا بلعمية (macrophages) المحفز بواسطة MCSF. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق ببيولوجيا الخلايا البلعمية البشرية. والميزة الأساسية لهذا التكتيك هي إمكانية الحصول بسهولة على مستنبتات الخلايا البلعمية المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية مع تقليل الاعتماد على توافر المتبرعين.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق كثافة الخلايا البلعمية المرغوبة والمزارع المتجانسة بشكل ثابت. لبدء هذا الإجراء، يتم الحصول على الخلايا أحادية النواة عن طريق فصادة الكريات البيضاء من متبرعين بشريين، ثم يتم إثراء الخلايا الوحيدة عن طريق الإزالة المرتجعة الطاردة المركزية المستمرة للخلايا أحادية النواة. بعد ذلك، يتم عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا الوحيدة مركزةً في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 milliliter لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا برفق في FBS متبوعاً بـ Dimethyl Sulfoxide لتحقيق تركيز نهائي قدره 90%FBS و10%Dimethyl Sulfoxide و50 times 10 to the six cells per milliliter. بعد ذلك، أضف 1 milliliter من معلق الخلايا إلى أنبوب حفظ بالتجميد (cryofile) فردي.

ضع ملفات التجميد (cryofiles) في حاوية تجميد الخلايا، وانقلها إلى مجمد بدرجة حرارة 80- °C لمدة 24 ساعة. بعد مرور 24 ساعة، انقل الحاوية إلى خزان ملفات تجميد بالنيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد. في هذه الخطوة، قم بإذابة ملف تجميد واحد من الخلايا عن طريق وضعه لفترة وجيزة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C.

عندما يذوب حوالي 70% من معلق الخلايا، أخرجه من الحمام المائي فوراً وانقله إلى درجة حرارة الغرفة. وبعد ذوبان معلق الخلايا تماماً، انقل 1 milliliter من محتويات ملف التجميد إلى 50 milliliters من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 2 millimolar L-glutamine، و 50 ng/mL M-CSF، و 25 ng/mL IL-10، و 10% FBS عند درجة حرارة 37 °C. بعد ذلك، انقل 25 milliliters من معلق الخلايا أحادية النواة إلى قارورتين من بلاستيك زراعة الخلايا بمساحة 75 cm².

قم بتحضين المزارع عند 37 درجة Celsius لمدة 48 ساعة. تذكر عدم تغيير الوسط حتى مرور 48 ساعة؛ وإلا فلن تلتصق الخلايا جيداً وسيتم شطفها. بعد 48 ساعة، اشطف المزارع ثلاث مرات باستخدام 10 milliliters من وسط RPMI 1640 المُدفأ مسبقاً.

قم بإزالة وسط الزرع برفق لتجنب إزاحة أي خلايا مرتبطة بشكل ضعيف. بعد ذلك، أضف وسطاً كاملاً وازرع الخلايا لمدة أسبوع واحد. قم بتغيير الوسط كل يومين حتى تتمايز الخلايا الوحيدة وتتكاثر بكفاءة لتصبح متلاحمة.

الآن، يتم شطف البلاعم المتمايزة في الدورق ثلاث مرات باستخدام 10 milliliters من محلول DPBS خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. بعد ذلك، يُضاف 10 milliliters من محلول 0.25%Trypson EDTA عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. ثم يوضع الدورق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة.

بعد ذلك، ينبغي أن تكون حوالي 90% من الخلايا البلعمية قد اتخذت شكلاً مستديراً وانفصلت. ثم، أضف 10 milliliters من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10%FBS لإيقاف عملية التريبسين. وإذا لزم الأمر، استخدم رافعة خلايا لإزالة الخلايا تماماً.

في بعض الأحيان، تظل العديد من الخلايا البلعمية ملتصقة خلال هذا الإجراء. ويمكن إزالة هذه الخلايا البلعمية بعد عملية الهضم بالتريبسين عن طريق تمرير رافع الخلايا عبر سطح القارورة. بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا البلعمية من القارورة إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 milliliter.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، قم ببساطة بإعادة تعليق الخلايا البلعمية برفق في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل. وبناءً على عدد الخلايا، أضف وسطاً غذائياً كاملاً إضافياً لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة عند الاستزراع.

بعد ذلك، يتم توزيع الخلايا البلعمية في 1.5 milliliters من الوسط في كل بئر من أطباق ذات 12 بئراً. عادةً ما يؤدي توزيع 1×10⁵ خلية في 1.5 milliliters من الوسط لكل بئر إلى إنتاج مزرعة خلوية شبه متلاحمة. وبعد عملية الاستزراع، تُحضن الخلايا البلعمية طوال الليل عند 37 °C للسماح بالتصاق الخلايا قبل استخدامها في التجارب.

يُظهر هذا الشكل الصور المجهرية بتباين الوجه للمونوسيتات الطازجة والمجمدة بالتبريد أثناء تمايزها إلى خلايا بلعمية بتحفيز من عامل تحفيز مستعمرات الخلايا البلعمية (MCSF) عند تكبير منخفض. التُقطت صور المونوسيتات في اليومين الثالث والسابع من الزرع في القارورة، وفي اليوم الثامن، أي بعد يوم واحد من حصادها وإعادة زرعها في طبق زرع مكون من 12 بئراً. ويظهر هنا مقارنة بين المونوسيتات الطازجة والمجمدة بالتبريد المستخدمة لإنتاج الخلايا البلعمية عند تكبير عالٍ.

الفجوات ذات المظهر المفكك في تباين الطور هي جسيمات امتصاص خلوي كبير (macropinosomes). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتوفر لديك فهم جيد لكيفية الحفظ بالتجميد ومن ثم تمايز الخلايا الوحيدة البشرية باستخدام عامل تحفيز مستعمرات الخلايا الوحيدة (MCSF) إلى خلايا بلعمية. لاحقاً، يمكن زراعة الخلايا البلعمية بكثافات خلوية محددة لإجراء التجارب.