الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس النقش في الجسم الحي لخلايا الدم المزروعة في منافذ نخاع العظم المتلقية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتصور العمليات الخلوية مثل التوجيه والتوسع والتوطين في منافذ نخاع العظام المختلفة للخلايا المكونة للدم من المتبرع بعد الزرع. يمكن أن يساعد هذا النهج ، الذي يستخدم بالاشتراك مع النماذج الحيوانية المهندسة ، في تحديد المسارات الجزيئية الحاسمة لتجديد الخلايا المكونة للدم.

على عكس الأنسجة أو تقنيات التصوير الأخرى ، يسمح الفحص المجهري داخل الحيوية بالتقاط التفاعلات من خلية إلى أخرى في حي على المستوى الخلوي وفي الوقت الفعلي. قررنا استخدام هذه الطريقة لتحديد ما إذا كانت البيئة المكروية لنخاع العظم هي الموقع الأولي لتطور مرض التكاثر النقوي الناجم عن فقدان إشارات Notch. تشمل التحديات التي يواجهها الأفراد الجدد في هذه التقنية تقليل القطع الأثرية للتنفس ، ووضع الرأس وتثبيته على النحو الأمثل وتجنب تشبع الصورة.

قبل الزرع بساعة إلى ساعتين ، رش فأر EGFP المحل بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، استخدم المقص الجراحي لعمل شق في جلد كل ساق حول الكاحل والملقط الجراحي لإزالة الجلد والفراء معا لفضح الأنسجة العضلية النظيفة. إزالة أكبر قدر ممكن من العضلات من الساقين.

ثم قم بقطع العظام في مفاصل الركبة والكاحل واستخدم إسفنج شاش لإزالة أي أنسجة عضلية متبقية من عظم الفخذ والظنبوب. اشطف العظام النظيفة في طبق من ستة آبار يحتوي على DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS. ثم انقل جميع عظام الساق الخلفية الأربعة إلى 10 ملليلتر من EDTA البارد في PBS إلى مدافع الهاون وسحق العظام بمدقة.

قم بإخراج خلايا نخاع العظم للحصول على معلق أحادي الخلية وقم بتصفية الملاط من خلال مرشح 70 ميكرون في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف الفلتر بملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من PBS. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من DMEM الطازج بالإضافة إلى 10٪ FBS.

للحقن ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ثم عد وضبط تركيز الخلايا إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في IMDM بدون مصل. ضع الخلايا على الجليد. بعد خمس إلى ست ساعات من الجرعة الثانية من الإشعاع ، قم بحقن ثلاث مرات 10 إلى خلايا نخاع العظم السادسة في وريد الذيل لكل متلقي مشع.

أضف النقطة الزمنية المناسبة بعد الزراعة. ضع الفأر المتلقي المخدر على وسادة تسخين 37 درجة مئوية وتأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم. ضع المرهم على عيون وقم بإعطاء 100 ميكرولتر من علامة الفلورسنت المناسبة عبر وريد الذيل.

بعد ذلك ، استخدم مقصات كهربائية صغيرة لإزالة الشعر من السطح الظهري لرأس ، متبوعا بتطبيق كريم مزيل الشعر. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة الكريم باستخدام إسفنج الشاش واشطف أي محلول متبقي بالمحلول الملحي. تطهير فروة الرأس بقطعة قطن مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪.

ثم استخدم ملقطا ومقصا دقيقا لعمل شق جلدي من 10 إلى 20 ملم على فروة الرأس لكشف سطح الجمجمة الظهرية الأساسي. باستخدام الحرير الجراحي 5-0 ، ضع خيوط تثبيت على كل جانب من جوانب الشق لتكوين سديلة لكشف الكالفاريوم للتصوير. ضع قطرة من الزيت على الجمجمة المكشوفة.

مع وضع الفأر في وضع ضعيف ، اغمر فروة الرأس المكشوفة في طبق زجاجي مليء بزيت المجهر. ثم ضع على مرحلة التصوير متعدد الفوتون مع الكالفاريوم فوق الهدف وقم بتغطية بوسادة تسخين 37 درجة مئوية. من الضروري أن يظل الرأس مستقرا في الموضع الصحيح أثناء الحصول على الصور متعددة الفوتونات.

استخدم جهازا تجسيما أو قم بتأمين الماوس بشريط لاصق حسب الاقتضاء. باستخدام نظام متحد البؤر المقلوب المعدل للتصوير متعدد الفوتونات ، اضبط ليزر الفوتون على 830 نانومتر. بعد ذلك ، افتح برنامج الحصول على الصور المناسب.

ضمن قائمة إعدادات الاستحواذ، تأكد من تحديد وضع المسح الضوئي أحادي الاتجاه واضبط سرعة المسح الضوئي على أربعة ميكروثانية لكل بكسل، ومعدل الإطارات إلى 512 × 512 بكسل والتكبير/التصغير على 1.5. حدد 20X واط في هدف 0.95. افتح نافذة قائمة الصبغة وحدد فوتونين.

ثم حدد مرآة RDM690 في نافذة وحدة التحكم في المجهر. في مسار الضوء ونافذة النرد ، حدد وحدة الليزر مربعين للتحقق مما إذا كان مصراع ليزر الفوتون مفتوحا. حدد مصباح EPI واختر مكعب مرشح B / G EPI.

ثم ركز الهدف على العينة لتصور تدفق الأوعية الدموية في مكانة نخاع عظم الكفاليوم ، باستخدام تشعب الوريد المركزي والخياطة التاجية كنقاط مرجعية. باستخدام الوضع غير الممسوح ضوئيا، حدد ثلاثة كاشفات خارجية وقم بتصوير العينة بمعدل مسح ضوئي يبلغ أربعة ميكروثانية لكل بكسل بدون حساب متوسط وقوة ليزر ثابتة وكسب كاشف للاستفادة من النطاق الديناميكي الكامل للكاشف بأقل قدر من التشبع. بعد جمع سلسلة من الأقسام من خلال عمق الأنسجة ، افتح برنامج تحديد كمية الصور المخصص من 3 إلى 4D والتصور المناسب.

تصور مكدسات Z بشكل تفاعلي باستخدام خوارزمية العرض ثلاثية الأبعاد المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم استخدم وحدة تجزئة الكائن الموضعي لتقسيم خلايا GFP وتطبيق المعالجة الحسابية المكدس للتخلص من خلايا GFP الإيجابية الخاطئة في القناتين الخضراء والحمراء. أخيرا ، استخدم وحدة التجزئة السطحية لإصلاح تجزئة الأوعية الدموية وسطح العظام ، وتطبيق مسافة التوتر X لخوارزميات البقعة إلى السطح لحساب مسافات الخلايا إلى أي من الأسطح البعيدة حسب الضرورة.

هنا ، تم تقديم مداخن Z التي تم جمعها من كل منطقة من المناطق القياسية الست من نخاع العظم كالفاريوم على أنها إسقاط ثلاثي الأبعاد للكثافة القصوى ، وإسقاط ظل ثلاثي الأبعاد بما في ذلك مكون العظام ، وصور مجزأة ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بتحديد كمية الخلايا وقياس مسافتها من العظام والأوعية. في هذه التجربة ، كشف التصوير في الجسم الحي للخلايا النخاعية في البيئة المكروية لنخاع العظم المعيب من الشق أن خلايا GFP المتحللة من المتبرع لها كفاءة توجيه مماثلة في النوع البري ومتلقي الضربة القاضية في 24 ساعة بعد الزرع بينما يظهرون نقشا مختلفا في نقاط زمنية لاحقة. أظهر تحليل ديناميكيات تمدد السلف النخاعي أن الخلايا المزروعة بنخاع العظم التكيفية توسعت بسرعة أكبر وبأعداد أكبر في متلقي الضربة القاضية بعد أسبوعين من الزرع.

توسعت خلايا نخاع العظم المتبرع في متلقي النوع البري في وقت لاحق ولكن بأعداد أعلى بضعفين من الخلايا المانحة ومتلقي الضربة القاضية في أربعة أسابيع ، وهو الوقت الذي تنخفض فيه الخلايا المانحة في نخاع العظم بالضربة القاضية لأنها تدخل بسرعة في الدورة الدموية. وبحلول ستة أسابيع ، يتم تسوية الاختلافات في عدد الخلايا المانحة في نخاع العظم. علاوة على ذلك ، يشير تحليل التجزئة ثلاثية الأبعاد للمنطقة الوسطى السفلية من الضربة القاضية والكالفاريا البرية في ستة أسابيع بعد زرع نخاع العظم إلى أن خلايا GFP المحللة موضعية على نفس المسافة من العظام في كلا النوعين من المتلقية ، ولكن من المثير للاهتمام أنها تقيم بعيدا عن الأوعية الدموية في الفئران بالضربة القاضية.

بمجرد إتقان التصوير ، يمكن إكمال تصوير نخاع العظم داخل الحيوية في ساعة واحدة و 30 دقيقة لكل فأر إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء استخدام هذا النهج ، من المهم أن تتذكر أخذ عينات من مناطق متعددة من نخاع عظم الكالفاريوم لكل فأر وتحليل ما لا يقل عن ثلاثة فئران لكل تجربة لمعالجة أي اختلافات داخل العينة وبينها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين زرع نخاع العظم والتصوير داخل الحيوية لتحديد حركية نقش مجموعة سكانية فرعية معينة من الدم في البيئة المكروية لنخاع العظام.