وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

الهدف العام من هذه المنهجية هو قياس امتصاص الجلوكوز والناقل الخاص به في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الوحيدة. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة، مثل ما هي أهمية استقلاب الخلايا المناعية في نتائج المرض؟ وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في كونها سريعة، وسهلة التنفيذ، ولا تتطلب مواد تفاعلية، كما تتطلب حجماً صغيراً فقط من الدم.

في غضون ساعة واحدة من جمع عينات الدم، في أنابيب مضاد التخثر citrate ACD-B، ضع العينات داخل كابينة السلامة البيولوجية. بعد ذلك، أضف 100 µL من الدم من كل عينة في أنابيب بولي بروبيلين منفصلة، وعالج الخلايا بـ 2 mL من محلول التحلل 1X على الثلج، مع السحب والضخ بلطف للمزج. وبعد 15 دقيقة، قم بطرد الخلايا مركزياً ثم اتبع ذلك بعمليتي طرد مركزي إضافيتين في محلول الغسل المنظم.

بعد الغسلة الثانية، استخدم ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الطافية بعناية، ثم أعد تعليق الرواسب في 100 µL من محلول الغسل على الثلج. ولتحديد المجموعات الفرعية المحددة من الخلايا الوحيدة، قم بصبغ الخلايا باستخدام 5 µL من الأجسام المضادة المناسبة لكل 100 µL من الخلايا، لمدة 30 دقيقة على الثلج في الظلام. وفي نهاية فترة التحضين، اغسل العينات مرتين بمحلول الغسيل وقم بتثبيت الخلايا باستخدام 200 µL من 0.5% formaldehyde في PBS.

بعد ذلك، يتم تحليل الخلايا خلال 24 ساعة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) القادر على الكشف عن أربعة ألوان. ولتقييم امتصاص الجلوكوز في المجموعات الفرعية للخلايا الوحيدة (monocyte subpopulations)، يتم نقل 90 µL من الدم من كل عينة إلى أنابيب بولي بروبيلين منفصلة، وإضافة 10 µL من نظير الجلوكوز الفلوري المطلوب إلى الدم. يتم رج الأنابيب برفق للمزج، ثم تغطية العينات بورق ألومنيوم.

بعد ذلك، يتم وضع الخلايا عند 37 درجة Celsius لمدة 15 إلى 30 دقيقة، تليها عملية نقل فورية إلى الثلج. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلتر من FACS lysing solution إلى الأنابيب، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً. ثم، قم بإجراء عملية طرد مركزي ثانية في wash buffer.

قم بسكب السائل الطافي، ثم صبغ الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المناسبة والمطلوبة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في الظلام. بعد ذلك، اغسل العينات في 4 mL من محلول الغسيل المنظم المبرد بالثلج، وأعد تعليق الرواسب في 200 إلى 300 µL من PBS المبرد بالثلج، وقم بتحليل الأنابيب خلال 10 دقائق. بالنسبة لتحليل قياس التدفق الخلوي، استخدم أولاً العينات الضابطة غير المصبوغة والمصبوغة بشكل فردي لضبط التعويض.

بعد ذلك، وفي برنامج تحليل الخلايا المفردة المناسب، افتح العينة الأولى في مخطط تشتت أمامي وجانبي (forward by side scatter plot)، وقم بتحديد الخلايا الوحيدة (monocytes) كما هو موضح. ثم، انقر نقراً مزدوجاً على مجموعة الخلايا الوحيدة المحددة، وقم بتحديد المجموعة السالبة لـ CD3. الآن، انقر نقراً مزدوجاً على المجموعة السالبة لـ CD3، واضبط المحور السيني لعرض صبغ CD14، والمحور الصادي لعرض صبغ CD16.

بعد ذلك، ولقياس امتصاص الجلوكوز أو ناقله في مجموعة فرعية محددة من الخلايا الوحيدة، قم بإنشاء المخططات التكرارية المناسبة. ثم، في حال وجود مجموعات خلوية محددة، استخدم عينات FITC igG الضابطة لضبط البوابة وتحديد النسبة المئوية الإجمالية للخلايا الوحيدة موجبة CD14 في كل عينة. يوضح الشكل هنا استراتيجية تحديد البوابات الأولية لعزل الخلايا الوحيدة عن طريق تشتت الخلايا واستبعاد الخلايا التائية عن طريق تحديد البوابات ضمن المجموعة سالبة CD3.

يتم بعد ذلك تحديد بوابات الخلايا الوحيدة بناءً على تعبير CD14 وحده، أو بالاشتراك مع CD16 لتحديد إجمالي الخلايا الوحيدة أو المجموعات الفرعية للخلايا الوحيدة. ويمكن ملاحظة مجموعات متميزة من الخلايا الوحيدة الموجبة لـ CD14 والموجبة لناقل الغلوكوز Glut-1، ولا سيما في خلايا الدم البيضاء المتداولة التي تم الحصول عليها من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). كما يمكن ملاحظة خلايا موجبة لـ CD14 وموجبة لـ Glut-1 ضمن مجموعات فرعية محددة من الخلايا الوحيدة لدى الأفراد غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وإن كانت هذه المجموعات أكثر وضوحاً لدى المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

كما هو متوقع من بيانات تعبير ناقلات الجلوكوز، يتم أيضاً امتصاص نظير الجلوكوز 2-NBDG بكميات أعلى في خلايا الأفراد المصابين بفيروس HIV. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعة ونصف إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم الحد من التعرض للضوء في جميع المناطق.

بعد عمليات امتصاص نظائر الجلوكوز، يمكن صبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة لسطح الخلية لتحديد مجموعات مناعية محددة تهمك دراستها. وبعد تطوير هذه الطريقة، يمكن استخدامها لتحديد كيفية تأثير HIV على استقلاب الخلايا المناعية، كما يمكن للباحثين الآخرين استكشافها في مجالات مختلفة، مثل علم المناعة وعلم الفيروسات وأبحاث السرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد حول كيفية الكشف عن ناقل الجلوكوز الأول وامتصاص الجلوكوز في الخلايا المناعية.

لا تنسَ أنه عند العمل مع العوامل المعدية، يجب اتباع إجراءات السلامة القياسية.