وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

الهدف العام لهذه المنهجية هو قياس امتصاص الجلوكوز وناقله على مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا الوحيدة. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل ما هي أهمية استقلاب الخلايا المناعية في نتائج المرض؟ تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في أنها سريعة وسهلة الأداء ولا تتطلب أي مواد تفاعلية ولا تتطلب سوى كمية صغيرة من الدم.

في غضون ساعة واحدة من جمع عينات الدم ، في أنابيب مضادة للتخثر ACD-B ، ضع العينات في خزانة السلامة البيولوجية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الدم من كل عينة إلى أنابيب بولي بروبلين فردية ، وعالج الخلايا بملليلترين من محلول التحلل 1X على الثلج ، مع سحب العينة برفق للخلط. بعد 15 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا واتبع ذلك بدورتين أخريين في مخزن الغسيل.

بعد الغسيل الثاني ، استخدم ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية ، وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل على الجليد. لتحديد المجموعات السكانية الفرعية المحددة للخلايا الأحادية ، قم بتلطيخ الخلايا بخمسة ميكرولترات من الأجسام المضادة المناسبة لكل 100 ميكرولتر من الخلايا ، لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل العينات مرتين في محلول الغسيل وقم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.5٪ فورمالديهايد في PBS.

بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا في غضون 24 ساعة على مقياس التدفق الخلوي القادر على اكتشاف أربعة ألوان. لتقييم امتصاص الجلوكوز للمجموعات السكانية الفرعية للخلايا الوحيدة ، قم بنقل 90 ميكرولترا من الدم من كل عينة إلى أنابيب بولي بروبلين فردية ، وأضف 10 ميكرولترات من نظير الجلوكوز الفلوري الذي يهم الدم. انقر فوق الأنابيب برفق للخلط ، وقم بتغطية العينات بورق الألمنيوم.

بعد ذلك ، ضع الخلايا على 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، متبوعا بنقلها الفوري إلى الجليد. بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من محلول التحلل FACS إلى الأنابيب ، وقم بالطرد المركزي للخلايا. ثم قم بإجراء عملية طرد مركزي ثانية في عازلة الغسيل.

صب المادة الطافية ، وصمة عار الخلايا بالأجسام المضادة المناسبة ذات الأهمية لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد ذلك ، اغسل العينات في أربعة ملليلتر من محلول الغسيل المثلج ، وأعد تعليق الكريات في 200 إلى 300 ميكرولتر من PBS المثلج ، وقم بتحليل الأنابيب في غضون 10 دقائق. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، استخدم أولا عينات التحكم غير الملطخة والملطخة بشكل فردي لتعيين التعويض.

بعد ذلك ، في برنامج التحليل أحادي الخلية المناسب ، افتح العينة الأولى في مخطط مبعثر أمامي ، وقم ببوابة الخلايا الوحيدة كما هو موضح. ثم ، انقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة الخلايا الوحيدة المسورة ، وقم ببوابة السكان سالبين CD3. الآن انقر نقرا مزدوجا فوق السكان سالبين CD3 ، واضبط المحور x لعرض تلطيخ CD14 ، والمحور y لعرض تلطيخ CD16.

بعد ذلك ، لقياس امتصاص الجلوكوز أو ناقله في مجموعة سكانية وحيدة معينة ، قم بإنشاء الرسوم البيانية المناسبة. بعد ذلك ، في حالة وجود مجموعات خلايا محددة ، استخدم عينات التحكم FITC igG لضبط البوابة وتحديد النسبة المئوية الإجمالية للخلايا الوحيدة الإيجابية ل CD14 في كل عينة. هنا ، يتم عرض استراتيجية البوابات الأولية لعزل الخلايا الوحيدة عن طريق تشتت الخلايا واستبعاد الخلايا التائية عن طريق البوابات داخل السكان السلبين CD3.

ثم يتم بوابات الخلايا الوحيدة لتعبير CD14 وحده ، أو بالاشتراك مع CD16 لتحديد إجمالي الخلايا الوحيدة أو المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الوحيدة. يمكن ملاحظة مجموعات مميزة من الخلايا الوحيدة الإيجابية لناقل الجلوكوز Glut-1 الإيجابية CD14 ، وعلى الأخص في خلايا الدم البيضاء المنتشرة التي تم الحصول عليها من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن أيضا ملاحظة الخلايا الإيجابية ل CD14 Glut-1 داخل مجموعات فرعية محددة من الخلايا الوحيدة في الأفراد غير المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ، على الرغم من أن هذه المجموعات السكانية تكون أكثر وضوحا في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

كما هو متوقع من بيانات التعبير عن ناقل الجلوكوز ، يتم امتصاص الجلوكوز التناظري 2-NBDG أيضا بكميات أكبر بواسطة خلايا الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعة ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحد من التعرض للضوء في جميع المناطق.

بعد امتصاص الجلوكوز التناظري ، يمكن تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة لسطح الخلية لتحديد مجموعات مناعية معينة تهتم بها. بعد تطويرها ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد كيفية تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على عملية التمثيل الغذائي للخلايا المناعية ، ويمكن أيضا استكشافها من قبل باحثين آخرين ، في مجالات مختلفة ، مثل علم المناعة وعلم الفيروسات وأبحاث السرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف ناقل الجلوكوز الأول ، وامتصاص الجلوكوز في الخلايا المناعية.

لا تنس أنه عند العمل مع العوامل المعدية ، يجب استخدام إجراءات السلامة القياسية.