Name: قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: تعلم قياس البلعمة والانفجار التأكسدي للوحيدات والحبيبات في الدم البشري باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذه التقنية البسيطة تساعد الباحثين في دراسة وظائف المناعة الفطرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أن نعترف زاك شو كيسي جون، ولين Cialdella كام على المساعدة التي قدموها خلال الاستفادة المثلى من هذا الإجراء.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

توفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد مؤشرين للمحببة وظيفة الوحيدات. لقد حددنا بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح هذا الاختبار. واحدة من هذه الخطوة هي حضانة الجليد حمام الذي يحدث مباشرة قبل إضافة البكتيريا. سوف تبريد شامل لجميع عينات تقليل تأثير درجة الحرارة على البلعمة وOB النشاط. خطوة حاسمة أخرى هي إضافة البكتيريا على كل عينة. و8: 1 البكتيريا: نسبة بلعمية تنتج أفضل النتائج. لكن باحثين آخرين قد تجد أن هذه النسبة سوف تحتاج إلى تعديل لتحقيق نتائج مناسبة. خطوة حاسمة أ...

ومحببة والوحيدات البلعمة / التأكسدي انفجار (OB) النشاط الاختبار هو بسيط، وتقنية مستقيم إلى الأمام التي كثيرا ما تستخدم لجمع المعلومات عن وظيفة المناعة الفطرية التالية ممارسة طويلة ومكثفة. 1-4 عند دراسة استجابة الجهاز المناعي ل حافز، المحببة وحيدات ذات أهمية خاصة لأنها تلعب دورا محوريا في الدفاع المضيف وهي الخلايا المناعية الأولى لتتراكم في موقع الإصابة. 5 العدلات، وهو نوع من محببة، هي الخلايا الأولى للنقل من داخل العضلات التالفة الأنسجة التالية ممارسة مكثفة. 6 البلعمة والنشاط OB هي التدابير الأكثر شيوعا من المحببات والوحيدات وظيفة و 7 و يفضل كمؤشرات للالفطرية وظيفة الخلايا المناعية بسبب دورها المركزي في كل من عملية العدوى وعملية الإصلاح. الفحص الموضحة في هذه utili مخطوطةZES تدفق الأساسي الكريات لتوفير تحديد كمية محببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB في الدم الكامل. استخدام الدم الكامل في هذه التقنية هو مفيد لأنه يسمح للفحص لإجراء دون إجراء تنقية تستغرق وقتا طويلا. هذا الاختبار يمكن بسهولة أن يتم تعديل لاستيعاب مجموعة متنوعة من التصاميم البحوث وقدرات المختبر. على سبيل المثال، لياو وآخرون تستخدم تقنية مماثلة لاظهار ان النشاط العدلات OB وزيادة ونقص العدلات البلعمة التالية إصابات في الدماغ. 8 وفي مثال آخر، وصفت McFarlin وآخرون. تعديلا أنيقة من هذه التقنية التي تستخدم allophycocyanin (APC ) -conjugated CD66b وجنبا إلى جنب عالية الأداء APC مترافق CD45 وضع العلامات مع الصورة القائمة على التدفق الخلوي لتصنيف المحببة من حيث الأنشطة البلعمة وOB بهم. 7،9 وقد استخدم فريق البحث لدينا التعديلات المختلفة لهذه الشركة المصرية للاتصالاتchnique كمؤشر على وظيفة المناعة الفطرية في السكان يعانون من زيادة الوزن، السمنة، ورياضية لنحو 20 عاما. 10،11 النص أدناه سوف توفر للقارئ مع إرشادات خطوة بخطوة لأداء هذا الاختبار وتسليط الضوء على المجالات التي يمكن للقارئ أن تتكيف لتلبية احتياجات أبحاثهم.

<table><tbody><tr><td>أنابيب 12 × 75 مم ، مع غطاء</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>ستحتاج إلى أنبوبين لكل عينة ("H" و "F") بالإضافة إلى 3 أنابيب لكل دفعة (لعناصر التحكم في الفحص ؛ "F" و "H" و "Blood فقط").</td></tr><tr><td>PBS (10x) ، درجة الحموضة 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>سطح الزجاجة 0.2 & micro ؛ م مرشح أسيتات السليلوز (سعة 500 مل)</td><td>فيشر ساينتيك</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>الجلوكوز ، مسحوق</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك (اللامائي ، تم اختبار زراعة الخلايا ، واختبار زراعة الخلايا النباتية)</td> <td>سيجما-ألدريتش</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدرات</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي هيدرو إيثيديوم (هيدروإيثيدين) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي الميثيل سلفوكسيد (DMSO) تقنيات الحياة اللامائية</td><td></td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>المكورات العنقودية الذهبية&nbsp;( سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، الفلورسين المترافق (FITC) Life</td> <td>Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>المكورات العنقودية الذهبية&nbsp;( سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، محلول</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue غير المسمى ، 0.4٪</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4.0 مل vacutainer يحتوي على 7.2 مجم K2EDTA ، VWR المجفف بالرش</td><td></td><td>BD367861</td><td>ستحتاج إلى 1 K2EDTA أنبوب جمع الدم لكل عينة.</td></tr><tr><td>4.0 مل فراغ يحتوي على 68 وحدة USP ليثيوم هيبارين ،</td><td>VWR</td><td>مطلي بالرش BD367884</td><td>ستحتاج إلى 1 أنبوب ليثيوم هيبارين لجمع الدم لكل عينة.</td></tr><tr><td>كولتر تيار متردد & middot ؛ T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e. ، محلل أمراض الدم</td></tr><tr><td>COULTER AC & middot ؛ T 5diff شطف</td><td>بيكمان كولتر</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>كولتر AC & middot ؛ T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER AC & middot ؛ T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>كولتر AC & middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER AC & middot ؛ T 5diff Cal Calibrator</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER AC & middot ؛ T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluent</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro ؛ ل أطراف ماصة ممتدة</td><td>الطول VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>وعاء ثلج معزول</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>لحمام الماء المثلج.</td></tr><tr><td>رف أنبوب معدني مفتوح</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>تقنيات مصل الجنين</td> البقري <td></td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep محطة عمل</td><td>بيكمان كولتر</td><td>6605429</td><td>i. ، محطة عمل تحضير ليز الخلية الآلي</td></tr><tr><td>نظام كاشف ImmunoPrep</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i. ، نظام كاشف إصلاح RBC Lyse / WBC</td></tr><tr><td>نظام قياس التدفق الخلوي Cytomics FC500 MCL مع برنامج CXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow غمد السائل</td><td>بيكمان كولتر</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>كولتر كلينز</td><td>بيكمان كولتر</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>فحص التدفق الفلوروسفير &nbsp ؛</td><td>بيكمان كولتر</td><td>6605359</td><td>i. ، المحاذاة والتحقق من السوائل الفلوروسفير</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo Flow</td><td><Jo >em على سبيل المثال ، برنامج تحليل قياس التدفق</td></tr> الخلوي <tr><td>برنامج Excel</td><td>Microsoft Microsoft</td><td>Excel</td> <td> أي ، برنامج جداول البيانات الإلكترونية</td></tr></tbody></table>

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

يمكن استخدام مقايسة نشاط الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة والانفجار التأكسدي (OB) لدراسة الجهاز المناعي الفطري. توفر هذه المخطوطة المنهجية اللازمة لإضافة هذا الاختبار إلى ترسانة علم المناعة للتمرين. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الاختبار في تحضير قطعتين ("H" و "F") من الدم الكامل (الهيبارين). بعد ذلك ، يضاف ثنائي هيدروإيثيديوم إلى H aliquot ، ويتم تحضين كلا الجزأين في حمام مائي دافئ متبوعا بحمام ماء بارد. بعد ذلك ، المكورات العنقودية الذهبية (المكورات العنقودية الذهبية) يضاف إلى H aliquot ويضاف المكورات العنقودية الذهبية المسمى بالفلورسين isothiocyanate إلى F aliquot (البكتيريا: البلعمة = 8: 1) ، ويتم تحضين كلا القسمين في حمام مائي دافئ متبوعا بحمام ماء بارد. بعد ذلك ، يضاف التريبان الأزرق إلى كل كمية لإخماد التألق خارج الخلية ، ويتم غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. بعد ذلك ، يتم تحلل خلايا الدم الحمراء ، ويتم إصلاح خلايا الدم البيضاء. أخيرا ، يتم استخدام مقياس التدفق الخلوي وبرنامج التحليل المناسب لقياس البلعمة المحببة والخلايا الوحيدة ونشاط OB. تم استخدام هذا الاختبار لأكثر من 20 عاما. بعد مجهود ثقيل ومطول ، يعاني الرياضيون من زيادة كبيرة ولكنها عابرة في البلعمة وانخفاض ممتد في نشاط البلعمة. ترتبط الزيادة بعد التمرين في البلعمة بالالتهاب. على عكس الأفراد ذوي الوزن الطبيعي ، فإن البلعمة المحببة والخلايا الوحيدة مرتفعة بشكل مزمن لدى المشاركين الذين يعانون من زيادة الوزن والسمنة ، ويرتبط ارتباطا متواضعا بالبروتين التفاعلي C. باختصار ، يقيس هذا الاختبار القائم على قياس التدفق الخلوي البلعمة ونشاط البلعمة ونشاط البلعمة ويمكن استخدامه كمقياس إضافي للالتهاب الناجم عن ممارسة الرياضة والسمنة.

ممارسة طويلة ومكثفة لها آثار عميقة على وظيفة المناعة الفطرية، بما في ذلك الطبيعية وظيفة القاتل الخلية، استجابة بلعم بوساطة خلوى للعدوى الفيروسية، ومحببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB. وتشير دراسات متعددة أن محببة والوحيدات زيادة البلعمة بشكل كبير بعد ممارسة، والتي تعكس الالتهاب الناجم عن تلف العضلات ومطالب الأيضية. في المقابل، يقلل محببة وOB الوحيدات النشاط بعد ممارسة الرياضة وقد يكون مؤشر المناعة واحد من زيادة التعرض للعدوى. على سبيل المثال، <stron...

الغرض من هذه المخطوطة هو تقديم طريقة لقياس البلعمة الوحيدة والخلايا الحبيبية ونشاط الانفجار التأكسدي في عينات الدم البشري.

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

الهدف العام من هذا المقايسة هو قياس نشاط البلعمة والاندفاع التأكسدي للخلايا المحببة والخلايا الوحيدة في الدم الكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة، مثل كيفية تأثير تدخل غذائي معين على الاستجابة المناعية تجاه التمرينات الرياضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مقايسة بسيطة ومباشرة يمكن تعديلها بسهولة لتتناسب مع الموارد المختبرية المتاحة والاهتمامات البحثية.لقد استُخدم هذا المقياس لوظيفة المناعة الفطرية على مدار العقدين الماضيين في العديد من تجارب التمارين الرياضية التي أجريناها، وسنشارك بعض هذه البيانات لاحقاً في الفيديو. قبل البدء في الإجراء، استخدم محلل الدم لإجراء فحص تعداد دم كامل مع تحليل تفريقي لكريات الدم البيضاء على عينات الدم وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتدوين تعداد كريات الدم البيضاء بوحدة cells per milliliter، وقيم النسبة المئوية للخلايا المتعادلة والخلايا الوحيدة للعينات.بعد ذلك، وبالنسبة لكل أنبوب تجريبي وأنبوب ضابط، استخدم رأس ماصة ممتد الطول لنقل 100 µL من كل عينة دم كامل من أنبوب جمع الدم الذي يحتوي على الليثيوم هيبارين إلى قاع أنبوب مقاس 12 × 75 مم مصنف بشكل مناسب. عند نقل جميع كميات الدم، أضف 10 µL من محلول HE العامل إلى الأنابيب المصنفة بالحبر الأحمر والحرف H، بما في ذلك أنبوب HE الضابط. ثم انزع أغطية الأنابيب.قم برج العينات باستخدام جهاز المرج (vortex) لفترة وجيزة، ثم انقل الأنابيب إلى حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C في حامل معدني مفتوح مع الرج اللطيف كل خمس دقائق. بعد مرور 15 دقيقة، انقل الحامل والأنابيب بسرعة إلى حمام مائي مثلج لمدة 12 دقيقة مع الرج اللطيف كل خمس دقائق. في نهاية فترة الحضن، أضف الحجم المناسب من محلول العمل غير المسمى لـ S.aureus إلى الأنابيب المحددة بالحبر الأحمر وبالرمز H، بما في ذلك أنبوب التحكم HE.قم برج الأنابيب لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex مع إغلاق الأغطية. بعد ذلك، أضف الحجم المناسب من محلول العمل لـ S.aureus المسمى بـ FITC إلى الأنابيب المميزة بالحبر الأسود والحرف F، بما في ذلك أنبوب التحكم بـ FITC، وقم برج العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex. بعد ذلك، قم بتحضين جميع الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 20 دقيقة مع الرج كل خمس دقائق، يليه تبريد لمدة دقيقة واحدة في ماء مثلج.بعد وضع العينات في درجة حرارة الغرفة، استخدم ماصة متكررة لإضافة 100 µL من محلول الإخماد المبرد بالثلج إلى جميع الأنابيب، ثم قم برج العينات بجهاز الفورتكس. أعد العينات إلى حمام الثلج. بعد مرور دقيقة واحدة، استخدم الماصة المتكررة لإضافة 1 mL من محلول PBS المبرد بالثلج إلى كل أنبوب.بعد ذلك، قم برج الأنابيب باستخدام جهاز المزج الدوامي (vortex) وأضف 2 mL إضافية من PBS إلى العينات. الآن، قم بطرد الخلايا مركزياً واشفط السائل الطافي. وباستخدام الماصة التكرارية، أضف 50 µL من FBS المبرد بالثلج إلى الأنابيب.بعد الرج الدوامي، انقل جميع الأنابيب إلى جهاز الدوار (carousel). استخدم محطة عمل آلية لتحضير تحلل الخلايا لتحليل خلايا الدم الحمراء وتثبيت خلايا الدم البيضاء وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ولتحليل نتائج المقايسة عن طريق قياس التدفق الخلوي، افتح برنامج الحصول على البيانات الخاص بنظام قياس التدفق الخلوي وأنشئ بروتوكولاً جديداً.اختر FITC لمعامل FL1 لاختبار البلعمة وHE لمعامل FL2 لاختبار نشاط الانفجار التأكسدي. قم بإنشاء مخطط نقطي للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، ومخطط تكراري لـ FL1، ومخطط تكراري لـ FL2. ثم أنشئ مناطق مضلعة لمجموعات خلايا الدم البيضاء، والخلايا المحببة، والخلايا الوحيدة على مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، وأنشئ مناطق خطية على المخططات التكرارية.قم الآن بتشغيل عينة الضابط السلبي المكونة من الدم فقط، تليها عينات الضابط الإيجابي لـ HE وFITC، مع مراجعة المدرجات التكرارية وضبط جهود أنبوب المضاعف الضوئي لقناتي FITC وPE حسب الضرورة. ثم ابدأ عملية الحصول على البيانات لعينات الضابط. وبعد فترة موازنة مدتها 15 دقيقة، قم بتحميل العينات التجريبية في القرص الدوار وفقاً للترتيب الوارد في قائمة العمل، وابدأ تحليل عينات الدراسة.لتقييم النشاط البلعومي للعينات، قم أولاً بتجميع كافة ملفات بيانات وضع القائمة للعينات الموسومة بـ F والعينات الضابطة في مجلد واحد، ثم اسحب الملفات إلى مساحة العينات في برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. انقر نقراً مزدوجاً على عينة ضابطة واستخدم أداة تحديد البوابة المضلعة (polygon gate selector) لتعيين بوابة لمجتمع خلايا الدم البيضاء الكلي، مع الحرص على تضمين جميع الخلايا الموجودة عند حواف المخطط. قم بتسمية هذه البوابة WBC.انقر نقراً مزدوجاً على بوابة WBC واستخدم محدد البوابة البيضاوي لتعيين بوابة الخلايا اللمفاوية. قم بتسمية البوابة وفقاً لذلك، واسحب النسبة المئوية لبيانات البوابة إلى الجانب بحيث يمكن رؤية الخلايا بوضوح. بعد ذلك، استخدم محدد البوابة المضلعة لتعيين بوابة الخلايا المحببة وبوابة الخلايا الوحيدة.قم بتسمية كل بوابة وفقاً لذلك واسحب النسبة المئوية لبيانات البوابة إلى الجانب. انقر نقراً مزدوجاً على عينة تحكم FITC متبوعة ببوابة الخلايا المحببة (granulocyte gate)، واستخدم القوائم المنسدلة لضبط المحور X على FL1 والمحور Y على التشتت الجانبي، أو SS. استخدم أداة اختيار البوابة المربعة لتحديد بوابة سلبية للبلعمة وبوابة إيجابية للبلعمة. قم بتظليل بوابة البلعمة الإيجابية لمجتمع الخلايا المحببة.بعد ذلك، انقر فوق Workspace ثم Add Statistic. حدد Geometric Mean و FL1 لإنتاج كثافة الفلورة للخلايا الحبيبية الموجبة للبلعمة، ثم انقر فوق Add. بعد ذلك، اختر frequency of parent statistic وانقر فوق Add لإنتاج النسبة المئوية للخلايا الحبيبية الموجبة للبلعمة.لتطبيق هذه الإعدادات على جميع عينات الدراسة، قم بتحديد كافة البوابات والإحصائيات التي تم إنشاؤها في عينة تحكم FITC، ثم اسحبها إلى منطقة "All Samples" في لوحة المجموعة. احفظ العمل كملف WSP في المجلد نفسه الذي يحتوي على مجلد بيانات وضع القائمة (list mode data). الآن، انقر فوق العينة التجريبية الأولى في مجموعة البيانات وتحقق من أن بوابة خلايا الدم البيضاء تتناسب بشكل مناسب مع توزيع الخلايا في كل عينة، مع تعديل حواف البوابة حسب الضرورة.انقر الآن على بوابة خلايا الدم البيضاء في العينة التجريبية الأولى، وتأكد من أن بوابات الخلايا المحببة والوحيدات والخلايا اللمفاوية تتناسب مع توزيع الخلايا في كل عينة من العينات، مع ضبط البوابات حسب الضرورة. بعد حفظ الملف، انقر على أيقونة محرر الجدول، واسحب كل إحصائية ذات أهمية إلى الجدول. انقر على "Create Table" لعرض البيانات في تنسيق جدول بيانات، واحفظ العمل كملف XLSX.ثم كرر التحليل لعينات نشاط الدفقة التأكسدية المحددة بـ H وملفات بيانات وضع القائمة الضابطة كما تم توضيحه للتو. وكما يظهر في هذه التجربة النموذجية، فإن البلعمة بوساطة الخلايا المحببة لبكتيريا S.aureus تزداد فوراً وبعد 1.5 ساعة من جولة ركوب دراجات لمسافة 75 كيلومتراً، ثم تعود إلى وضعها الطبيعي بحلول صباح اليوم التالي. وينخفض نشاط الدفقة التأكسدية للخلايا المحببة لمدة 21 ساعة على الأقل بعد هذا المستوى من النشاط.علاوة على ذلك، هناك ارتباط طفيف بين البلعمة في الخلايا المحببة ومستويات البروتين التفاعلي C في المصل، كما لوحظ في هذا التحليل لـ 106 امرأة يعانين من زيادة الوزن أو السمنة، مما يشير إلى أن ارتفاع نشاط البلعمة في الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة لدى الأشخاص في حالة الراحة قد يكون مؤشراً على وجود التهاب جهازي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها لحوالي 30 عينة في غضون سبع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تبريد العينات تماماً قبل إضافة البكتيريا للمساعدة في تقليل أي تباين غير مبرر بين العينات.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل قياس كمية السيتوكينات، لتحديد تأثير التدخل الذي أجريته على الاستجابة الالتهابية. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف تأثيرات مجموعة متنوعة من التغيرات في نمط الحياة ووظائف المناعة الفطرية لدى البشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية قياس البلعمة في الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة ونشاط الانفجار التأكسدي باستخدام مقياس تدفق الخلايا.لا تنسَ أن التعامل مع الدم البشري يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، وأنه يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، عند تنفيذ هذا الإجراء.

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

يوضح هذا الفيديو طريقة لقياس البلعمة للجراثيم الفطرية المسببة للأمراض المسماة ب FITC بواسطة الكريات البيض البشرية. يتم تمييز الجراثيم البلعمة من الجراثيم الملتصقة بالخلايا من خلال التلوين المضاد ، متبوعا بتحليل التدفق الخلوي.

قياس التدفق الخلوي الكمي لبلعمة الأبواغ الفطرية بواسطة الخلايا البلعمية البشرية

يوضح هذا الفيديو الاختبار لتأكيد نشاط البلعمة بواسطة الخلايا في دم الإنسان عن طريق قياس التدفق الخلوي. تؤكد الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة نشاطها البلعمي من خلال إظهار التألق الأخضر والأحمر الذي يؤكد وجود البكتيريا المبتلعة ونشاط الانفجار التأكسدي على التوالي.

اختبار لتقييم البلعمة ونشاط الانفجار التأكسدي في الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة

يعرض هذا الفيديو مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية تستخدم الخلايا الوحيدة الأولية من الدم المحيطي لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ مع خلايا الدم الحمراء R2R 2 R2 المضادة بالأجسام المضادة بولي D.

اختبار لدراسة البلعمة التي تحركها مستقبلات Fcγ في الطبقات الأحادية للخلايا الأحادية

الضامة الوحيدات المستمدة هي خلايا مهم من نظام المناعة الفطرية. هنا، نحن تصف وسيلة سهلة...

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخلايا.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

توضح هذه الطريقة تقنية لتقييم وظيفة الخلايا المحببة عن طريق قياس البلعمة للبكتيريا والانفجار التأكسدي في نفس الوقت. سمح قياس التدفق الخلوي المستند إلى الصورة بتحديد ثلاث مجموعات فرعية متميزة من الخلايا المحببة المنشطة والتي اختلفت جميعها في قدرتها الوظيفية النسبية.

الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة في المختبر

مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية (MMA) هي اختبار في المختبر يستخدم الخلايا الوحيدة الأولية المعزولة التي تم الحصول عليها من الدم الكامل المحيطي للثدييات لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ (FcγR).

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

هنا يمكننا وصف أساليب استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إلى أحداث متجولة واحد الصورة بالماوس الضامة البريتوني المقيم. ويمكن تمديد البروتوكولات إلى خلايا أخرى متجولة.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

المستدمية النزلية تحفز الالتهاب في الجهاز التنفسي. ستركز هذه المقالة على استخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر لتحديد الاستجابات المناعية بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا الليمفاوية استجابة لهذه البكتيريا.

تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية

لقد قمنا بتطوير تحسينات وطرق محدثة لمقايسة الخلية الأحادية أحادية الطبقة الحالية (MMA) ، حيث يتم استخدام البلاعم للمساعدة في التنبؤ بشكل أفضل بالأهمية السريرية للأجسام المضادة للخلايا الحمراء في طب نقل الدم وعلم المناعة. يسمى هذا الاختبار مقايسة البلاعم الأحادية (M-MA).

التنبؤ بأهمية الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء باستخدام اختبار البلاعم وحيدة الخلايا

يصف هذا العمل بروتوكولا موحدا في المختبر لتحديد ومقارنة معدلات البلعمة لخلايا الدم الحمراء الغريبة (البشرية) والخيفية (الفئران) بواسطة ضامة الفئران المعزولة.

تقييم كمي للبلعمة لكريات الدم الحمراء الخيفية والغريبة بواسطة ضامة الفئران في المختبر

تعلم قياس البلعمة والانفجار التأكسدي للوحيدات والحبيبات في الدم البشري باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذه التقنية البسيطة تساعد الباحثين في دراسة وظائف المناعة الفطرية.

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

استكشف المزيد من الفيديوهات