عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الخلايا البطانية للوريد السري البشري وتحليل ديناميكيات الهيكل الخلوي وهجرة الخلايا باستخدام تصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية. يمكن أن تساعد الطرق الموضحة في هذا الفيديو في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلية والجزيئية والبيولوجيا الميكانيكية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد كيفية تعديل شكل الخلية وحركتها عن طريق إشراك ECMs المختلفة.

العرض المرئي أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب تنفيذ خطوات تحضير العينة. إنها تتطلب معالجة دقيقة للخلايا في الوقت المناسب طوال العملية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لحركة الخلايا البطانية أثناء تكوين الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التحقيقات المجهرية لأي نظام نموذج خلية ملتصق تقريبا.

باستخدام الملقط ، التقط غطاء من جرة تخزين الإيثانول بنسبة 100٪ وقم بتمريره عبر لهب موقد بنسن لتعقيمه. ثم ضعه في طبق بتري 35 ملم. قم بإعداد غطاء واحد لكل عينة.

إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون الفبرونيكتين لكل مليلتر و 990 ميكرولتر من PBS. ثم ضع ماصة 250 ميكرولترا من المحلول على كل غطاء. انشر المحلول بالتساوي لتغطية السطح.

احتضان الغطاء لمدة ثلاث ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، اشطف كل غطاء ثلاث مرات بملليلترين من PBS. باستخدام مقياس كثافة الدم ، حدد عدد HUVECs المستزرعة وانقل حجما يحتوي على 100 ، 000 خلية لكل غطاء لتجارب عدم الهجرة ، أو 500 ، 000 خلية لكل غطاء لتجارب الهجرة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

قم بتدوير الخلايا عند 1 ، 400 مرة في G لمدة أربع دقائق لحبيبها. بعد الدوران ، لكل حالة يتم اختبارها ، قم بتعليق ما يصل إلى مليون خلية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي ودمجها مع ميكروغرام واحد من الحمض النووي (كدنا). انقل الخلايا إلى كوفيت التثقيب الكهربائي.

قم بنقل الخلايا وخليط الحمض النووي باستخدام البرنامج المخصص للتثقيب الكهربائي HUVEC. بعد ذلك ، أنقذ الخلايا المنقولة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي البطاني الكامل. بعد ذلك ، قم بوضع حجم الخلية المناسب على أغطية مغلفة بالفيبرونكتين.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات لإتاحة الوقت للتعبير عن تركيبات (كدنا). استعدادا للتصوير ، خذ شريطين 2.5 سم × 0.65 سم من الشريط على الوجهين وقم بتثبيتهما أفقيا على طول الحافة العلوية والسفلية لشريحة زجاجية نظيفة. لاحظ أنه من المهم السماح بمساحة صغيرة بين الشريط وحافة الانزلاق لإغلاق الغرفة.

قم بتركيب جانب خلية الغطاء لأسفل بحيث تستقر حافتا الغطاء على الشريط. استخدم ملقط للضغط برفق لتأمين الغطاء. باستخدام ماصة دقيقة، أضف 40 ميكرولترا من وسط التصوير بين الغطاء والانزلاق.

تأكد من أن المسافة بين الغطاء والشريحة مملوءة بالكامل بوسيط التصوير. امسح أي وسيط زائد بمناديل ورقية إذا لزم الأمر. أغلق جميع حواف الشريحة باستخدام VALAP الدافئ.

تحقق من عدم وجود تسرب عن طريق الضغط برفق على الغطاء الزجاجي. ضع الغطاء المركب والمغلق على مرحلة المجهر المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار ، التقط تسلسلات صور الفاصل الزمني وصور البروتين الفلوري الأزرق وصور DIC.

تحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة والتوطين المشترك كما هو موضح في المستند المصاحب. لإجراء مقايسة هجرة الخلايا ، بعد خطوة التثقيب الكهربائي ، أنقذ الخلايا المنقولة عن طريق إضافة 80 ميكرولترا من الوسط القاعدي البطاني الكامل. بعد ذلك، قم بوضع ماصة العينة التي يبلغ وزنها 80 ميكرولتر بالكامل كقطرة واحدة على مركز غطاء الغطاء المجفف المغطى بالفيبرونكتين.

لا تنشر القطرة. يعد تجفيف الغطاء ضروريا لمنع انفصال القطرة بمقدار 80 ميكرولتر عند ملامسة الغطاء. يسمح هذا النهج بتركيز HUVECs داخل مساحة صغيرة من الغطاء وبالتالي يعزز التكوين السريع لطبقة أحادية التقاء من الخلايا.

احتضان الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات لإتاحة الوقت للخلايا للالتصاق بطبقة أحادية التقاء. ثم اشطف الشرائح مرتين في وسط قاعدي بطاني كامل لإزالة أي خلايا لم تلتصق. لإنشاء حافة جرح على الطبقة الأحادية HUVEC ، استخدم الملقط لتثبيت الغطاء برفق في مكانه واسحب شفرة الحلاقة بإحكام عبر منتصف الطبقة الأحادية للخلية.

اسمح للخلايا بالتعافي في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بتجميع وتركيب أغطية للتصوير كما كان من قبل. احصل على صور تباين الطور على فترات 10 دقائق لمدة 12 ساعة باستخدام هدف طور فتحة عددية 10X 0.45 ومكثف مسافة عمل طويلة بفتحة رقمية 0.52.

استخدم لوحة اكتساب ND لبرنامج الحصول على الصور. أخيرا ، حدد تفرع HUVEC وترحيله كما هو موضح في المستند المصاحب. تم نقل HUVECs للتعبير عن mApple-المسمى EB3 ، وهو بروتين مرتبط بنهاية الأنابيب الدقيقة وتم التقاط صور الفاصل الزمني.

الصور الأولية ل EB3 على اليسار. تظهر مذنبات EB3 الزرقاء التي يتم تتبعها بواسطة برنامج plusTipTracker على اليمين. تم ربط المذنبات المكتشفة داخل كل إطار بناء على تغييرها في موضعها من إطار إلى آخر لإنشاء مسارات EB3 وتراكب مسار EB3 مرئي ، كما هو موضح هنا.

يظهر نمو الأنابيب الدقيقة البطيء وقصير العمر باللون الأحمر ، ويظهر نمو الأنابيب الدقيقة البطيء وطويل العمر باللون الأخضر ، ويظهر نمو الأنابيب الدقيقة السريع وقصير العمر باللون الأصفر ، ويظهر نمو الأنابيب الدقيقة السريع وطويل العمر باللون الأزرق. لتحليل تفرع الخلايا البطانية ، تم التقاط DIC وصورة فلوريسنت ل HUVEC فردي بتكبير 60 مرة. تم رسم حدود يدويا حول حافة الخلية في صورة الفلورسنت.

ثم تم تحديد أصول الفرع عن طريق رسم خط مستقيم عبر الفرع ومن خلال أكبر زاوية انحناء على جانبي الفرع. تم حساب الفروع التي كانت أطول من عرضها وطولها 10 ميكرون على الأقل وتم قياس الطول من أصل الفرع إلى الطرف البعيد للفرع. لتقييم هجرة حافة جرح الخلية البطانية ، تمت زراعة HUVECs بكثافة عالية وتم إجراء تصوير الفاصل الزمني للخلية الحية بعد الجرح كما هو موضح في هذا الفيديو.

كما هو موضح هنا ، هاجرت الخلايا البطانية لحافة الجرح اتجاهيا إلى منطقة الجرح. تم تحليل هذه الحركة باستخدام النواة كعلامة ائتمانية لتتبع سرعة الهجرة والثبات والمسافة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة ونقل وإعداد HUVECs لتجارب تصوير شكل الخلية وديناميكيات الهيكل الخلوي أو لدراسات هجرة خلايا حافة الجرح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل بولي أكريلاميد أو اقتران الكولاجين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بمشاركة الخلايا في ECMs المعدلة. شكرا على المشاهدة ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.