بروتوكول مفصل للتميز الخط خلية الفئران C1498 ونموذج أسوشيتد اللوكيميا ماوس ل

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف خلايا الفئران C1498 وسرطان الدم الحاد الذي تسببه بعد الحقن الوريدي في الفئران. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أن ابيضاض الدم النقوي الفئراني الناجم عن حقن خلايا C1498 يقدم العديد من ميزات المرض البشري. يمكن أن يساعد هذا النموذج الحيواني في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الدم مثل الآلية التي تؤدي إلى تطور سرطان الدم ونقص المناعة.

يمتد تأثير هذا النموذج الحيواني على علاج سرطان الدم لأنه يسهل اختبار العوامل الكيميائية والمناعية الجديدة. ابدأ بنقل أنثى C57 black 6 فأرة عمرها خمسة إلى ستة أسابيع إلى غطاء تدفق رقائقي معقم. ثم ضع في مصفاة.

بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة واحدة مزودة بإبرة قياس 29 مع 100 ميكرولتر من الخلايا. أمسك ذيل الطرف البعيد وقم بتطهير جلد الذيل بشاش مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪. استمر في حقن ببطء مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة في وريد الذيل الجانبي.

عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، قم بإزالة الإبرة واضغط برفق على مرأى من الحقن بشاش معقم. ثم أعد إلى قفصه مع المراقبة الدقيقة للأسابيع العديدة القادمة. بعد 17 إلى 19 يوما ، أدخل أنبوبا شعريا في القناة الإنسية لعين المخدر لسرطان الدم

سيتم سحب 100 إلى 200 ميكرولتر من الدم من الجيوب الأنفية إلى الأنبوب الشعري. قم بإزالة الأنبوب والتحكم في النزيف بالتطبيق اللطيف لإسفنجة شاش معقمة على العين. بعد ذلك ، انقل الدم إلى أنبوب EDTA وقم بتخزين الأنبوب على الجليد حتى عزل الخلية أحادية النواة.

لعزل خلايا الدم أحادية النواة ، أضف أولا PBS المكمل ب EDTA مليمولار واحد حتى حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر. ثم انقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 30 لوضع 500 ميكرولتر من محلول الفصل تحت الدم بعناية ، مع الحرص على عدم خلط الطبقات.

افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي واستخدم ماصة لنقل طبقة الخلية البيضاء أحادية النواة غير الشفافة إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ثم اغسل الخلايا المناعية في مليلتر واحد من PBS. قم بالطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للتلوين ، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لعزل نخاع العظم ، ضع الفأر على ظهره على لوح بلاستيكي وقم بتأمين أطراف. تطهير ب 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بقص كل ساق في الجزء العلوي من عظم الفخذ فوق المفصل واسحب الظنبوب برفق لفصلها عن عظم الفخذ.

استخدم الملقط والمقص لإزالة الجلد والعضلات من العظام ، ونقل العظام إلى طبق بتري على الثلج. استخدم المقص لإزالة الأطراف. ثم أدخل إبرة قياس 26 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من PBS البارد في نهاية عظم واحد في كل مرة وقم بغسل نخاع العظام في الطبق.

مرر معلق الخلية عبر طرف الإبرة عدة مرات لتعطيل خلايا نخاع العظم. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا من خلال مرشح جديد 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للحصول على تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلترين من المخزن المؤقت للتحلل.

املأ الأنبوب على الفور بما يصل إلى 50 مل من PBS البارد وقم بالطرد المركزي للخلايا. ثم, أعد تعليق حبيبات نخاع العظم في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في مخزن FACS البارد. لتحضير خلايا نخاع العظم للتلوين أولا ، ضع الشرائح في غرف يمكن التخلص منها باستخدام بطاقات ترشيح متصلة مسبقا وضع الغرف في جهاز طرد مركزي للخلايا.

أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل غرفة بطاقة مرشح وقم بالطرد المركزي للشرائح لفترة وجيزة. في نهاية الدوران ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل غرفة وقم بالطرد المركزي للخلايا. ثم قم بإزالة الشرائح بعناية من الغرف لتجفيف الهواء.

لتلطيخ خلايا نخاع العظم ، اغمر الشرائح في وعاء كوبلن يحتوي على محلول May-Grunwald لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى وعاء من محلول عازل بدرجة حموضة 6.8 لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل الشرائح إلى محلول Giemsa R لمدة 10 دقائق.

يليه غسل لمدة 10 ثوان بالماء المحايد لدرجة الحموضة. بعد الغسيل ، اترك الشرائح تجف في الهواء وقم بتطبيق قطرة واحدة من وسط التركيب على كل عينة. بعد ذلك ، ضع إحدى حواف زجاج الغطاء على الشريحة وقم بخفض زجاج الغطاء بحذر على الخلايا مع الضغط برفق لإزالة أي فقاعات هواء.

بالمقارنة مع التحكم ، تظهر المحقونة بخلايا C1498 تسللا هائلا لخلايا C1498 في نخاع العظام ، كما لوحظ المظهر الشبيه بالانفجار للخلايا. تظهر خلايا نخاع العظم المتسللة C1498 أنماطا ظاهرية أحادية الخلية والخلايا الحبيبية تدل على الخلايا أحادية الأرومات والخلايا النخاعية على التوالي ، وهي سمة من سمات ابيضاض الدم النقوي الحاد. يشير تحليل قياس التدفق الخلوي لترددات الخلايا أحادية النواة في عينات الدم من الفئران المحقونة C1498 إلى أن ما يقرب من ربع خلايا الدم البيضاء بأكملها يتكون من خلايا سرطان الدم.

تتشابه ترددات الخلايا الليمفاوية T و B بين الشاهدة المحقونة C1498. ومع ذلك ، لوحظت ترددات الخلايا الأحادية عند مستويات أعلى في الفئران المحقونة C1498 ، وهي سمة من سمات سرطان الدم النقوي الحاد. عند إجراء الكيمياء الخلوية وإجراءات May-Grunwald Giemsa ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على قيم الأس الهيدروجيني المناسبة ودرجات الحرارة وأوقات الحضانة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف ابيضاض الدم النقوي الحاد. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الدم لاستكشاف طبيعة سرطان الدم الحاد التلقائي والمستحث في النماذج الحيوانية الأخرى.