إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

الهدف العام من هذه التجربة هو تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا عضلية قلبية بكفاءة عالية وقابلية للتكرار. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول في مفاعل حيوي أو تعديله لتمايز الخطوط الخلوية التي تتسم بالحساسية تجاه زراعة الخلايا المفردة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في نمذجة أمراض القلب باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المحفزة متعددة القدرات.

تكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنية في كونها غير مكلفة وتتمتع بكفاءة عالية، وقابلية للتكرار، وقابلية للتطبيق على كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. مقدمة العرض اليوم هي حنان فنودي، طالبة الدكتوراه حالياً في معهد فيكتور تشانغ لأبحاث القلب، والقادمة إلينا من معهد رويان. قبل عملية الطلاء، استخدم فرشاة تنظيف وماءً مقطراً لإزالة أي غبار أو بقايا زراعة بشكل كامل من قارورة تدوير سعة 100 milliliter ذات بندول زجاجي.

بعد ذلك، املأ الدورق بـ 70% ethanol. وبعد مرور 30 دقيقة، اشطف الدورق بالماء المقطر، ثم املأه بـ five molar sodium hydroxide. وفي صباح اليوم التالي، اشطف الدورق تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق، ثم املأه بـ one molar hydrochloric acid.

بعد مرور 15 دقيقة، اشطف القارورة تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق أخرى، ثم اشطفها مرتين بماء مقطر مرتين. ضع القارورة في كابينة السلامة البيولوجية لتجف. بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من محلول السيلكون إلى القارورة، وقم بتدوير القارورة أفقياً لتغطية جميع الأسطح بالسيلكون.

سخن الدورق المطلي في فرن تجفيف لمدة ساعة واحدة عند 100 °C. وعندما يبرد الدورق، اشطفه ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة باستخدام الماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، قم بتعقيم الوعاء باستخدام الموصدة (autoclave) عند 121 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد تمرير الكريات غير المتمايزة، باستخدام طريقة تمرير الخلايا المفردة ثلاث مرات على الأقل، استخدم ماصة سعة 5 milliliter لنقل جميع الكريات غير المتمايزة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. اغسل الآبار باستخدام 1 milliliter من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لجمع أي كريات متبقية، واجمع سائل الغسيل مع الكريات التي تم حصادها. اترك الكريات لتترسب لمدة خمس دقائق لتكوين كتلة رخوة.

بعد ذلك، يتم سحب السائل الطافي مع الحرص على عدم إزالة أي من الكرويات. ثم تُغسل الكرويات بـ 1 mL من PBS لمدة خمس دقائق، وتُحضن في 5 mL من Trypsin EDTA عند 37 °C. وبعد مرور أربع إلى خمس دقائق، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 1 mL من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، واستخدام ماصة P1000 لتفكيك الكرويات إلى معلق من الخلايا المفردة.

بعد العد باستخدام طريقة استبعاد صبغة trypan blue، أعد تعليق الخلايا بتركيز 200,000 خلية لكل milliliter، في وسط مكيف مدعم بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ومثبط ROCK، ثم انقل 100 milliliters من معلق الخلايا إلى دورق المفاعل الحيوي السيليكوني. ضع الدورق على جهاز الرجاج بسرعة 35 RPM. وبعد مرور 24 ساعة، زد سرعة الرج إلى 40 RPM.

بعد مرور 48 ساعة، أوقف عملية التقليب لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق حتى تترسب جميع الكرويات المعاد تشكيلها في قاع القارورة، واستبدل نصف الوسط بوسط مُكيّف مُدعم بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي. بعد ذلك، أعد تشغيل جهاز التقليب بسرعة 40 RPM لمدة 24 ساعة أخرى، مع استبدال نصف الوسط باتباع العملية ذاتها يومياً على مدار الأيام الثلاثة التالية. وفي اليوم الخامس، أوقف جهاز التقليب لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق.

بعد ذلك، انقل جميع الكريات إلى أنبوب سعة 50 milliliter في 50 milliliters من الوسط الغذائي أو أقل. تخلص من أي كمية متبقية من الوسط الغذائي في الدورق، مع الحرص على عدم بقاء أي من الكريات داخل الوعاء. ثم، قم بإزالة الطافي بعناية من فوق الكريات المترسبة، واغسل التكتلات الخلوية في 25 milliliters من PBS المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.

بعد مرور خمس إلى عشر دقائق، قم بإزالة سائل الغسيل، وأعد تعليق الكرويات في 40 milliliters من وسط RPMI-B27 المكمل بمثبط glycogen synthase kinase-3، ومثبط ROCK، وكحول البولي فينيل. انقل جميع الكرويات مرة أخرى إلى قارورة المفاعل الحيوي. بعد ذلك، أضف وسط RPMI-B27 طازجاً حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 100 milliliters، وأعد تشغيل عملية التقليب بسرعة 40 RPM.

بعد مرور 24 ساعة، اتبع العملية ذاتها لتغيير الوسط إلى وسط RPMI-B27. وبعد مرور 24 ساعة إضافية، اتبع العملية ذاتها وقم بتغيير الوسط إلى RPMI-B27 مضافاً إليه IWP2 وpurmorphamine وSB43. اترك العينة لمدة 48 ساعة.

عادةً ما يتم ملاحظة أول نبض بعد سبعة أيام. وللتمايز السريع لخطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التي لم يتم تكييفها مع زراعة الخلايا المفردة، قم أولاً بمعالجة زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التي وصلت درجة تلاحمها إلى 70 إلى 80%، والمنماة على خلايا أرومة الليف الجنينية للفئران، باستخدام 5 milliliters من محلول التفكيك لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية. يجب ترك محلول التفكيك فقط حتى تصبح خلايا MEFs مستديرة وتصبح حواف مستعمرة hPSC واضحة.

إذا تُرِكت الخلايا لفترة طويلة جداً، فلن تتمايز بشكل صحيح. وفي الوقت المناسب، استبدل محلول التفكيك بسرعة بـ 75 milliliters من collagenase type IV، ثم قم بحضن الخلايا لمدة تتراوح بين خمس إلى 15 minutes عند 37 درجة Celsius، مع فحص المزرعة تحت المجهر كل بضع دقائق. وعندما تبدأ المستعمرات الكاملة في الانفصال، استبدل الـ collagenase بـ 1.5 milliliters من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، واستخدم ماصة P1000 لفصل مستعمرات الخلايا الكاملة برفق من قاع الطبق.

يجب فصل الخلايا بعناية لضمان عدم تفتت المستعمرات إلى قطع صغيرة. بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 5 mL لنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL، واغسل الآبار باستخدام 1 mL من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، مع تجميع أي خلايا متبقية في الأنبوب سعة 15 mL. بعد خمس دقائق من الترسيب، استبدل السائل الطافي بعناية بـ 2 mL من وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الطازج والمُدعم بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي.

باستخدام ماصة سعة 5 mL جديدة، انقل الخلايا إلى طبق فائق انخفاض الالتصاق، ثم حضن المستعمرات لمدة تتراوح من 6 إلى 12 ساعة. في نهاية فترة التحضين، استخدم ماصة سعة 5 mL لنقل تجمعات المستعمرات بعناية إلى أنبوب سعة 15 mL جديد، واجمع أي تجمعات متبقية عن طريق الغسل باستخدام وسط RPMI-B27. وعندما تترسب المستعمرات، استبدل السائل الطافي بوسط RPMI-B27 طازج مُدعم بمثبط glycogen synthase kinase-3، ثم انقل المستعمرات بعناية إلى أطباق مطلية باللامينين للالتصاق عند درجة حرارة 37 °C.

بعد مرور 24 ساعة، استبدل الوسط بوسط RPMI-B27. وبعد مرور 24 ساعة أخرى، استبدل الوسط بوسط RPMI-B27 الذي يحتوي على IWP2 وpurmorphamine وSB43. وعادةً ما يتم ملاحظة أول نبضة بعد سبعة أيام.

حتى الآن، تم اختبار بروتوكول التمايز في المعلق الساكن على خمسة خطوط من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وأربعة خطوط من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات، مما أدى إلى الحصول على كرويات نابضة بنسبة تزيد عن 90% من كل خط، وهو ما يثبت قابلية التكرار العالية لهذا البروتوكول بين مختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. وتظهر الكرويات المتمايزة سلوكاً مماثلاً في بيئة المفاعل الحيوي للمعلق المقلب كما هو الحال في النظام الساكن، حيث لوحظ نبض ما يقرب من 100% من الكرويات في اليوم 10. وبالفعل، تكشف مقاطع الكرويات النابضة التي تم جمعها في اليوم 30 عن التعبير السيتوبلازمي والنووي لكل من cardiac troponin T وعامل النسخ القلبي NKX2.5 على التوالي.

علاوة على ذلك، عند استبدال الكريات غير المتمايزة بتجمعات خلوية غير متمايزة، تظهر تجمعات نابضة بعد سبعة أيام من التمايز. ومن بين 42 خطاً من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات التي تم اختبارها، تولدت في المتوسط مجموعات خلوية إيجابية لبروتين cardiac troponin T بنسبة تزيد عن 60% بحلول اليوم 15. كما أظهرت التجمعات النابضة تعبيراً سيتوبلازمياً لبروتين cardiac troponin T وتعبيراً نووياً لبروتين NKX2.5 مماثلاً لما لوحظ في الكريات الناتجة عن المفاعل الحيوي ذو التعليق المقلب.

عند تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام خلايا hPSCs التي تم تكييفها للزراعة أحادية الخلية لثلاث ممرات على الأقل قبل البدء في عملية التمايز داخل المفاعل الحيوي. يمكن دمج هذا الإجراء مع طرق أخرى لإثراء الخلايا العضلية القلبية للحصول على مجموعة نقية من الخلايا. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للتسويق التجاري للخلايا العضلية القلبية المشتقة من hPSC.

تتمتع هذه التقنية بإمكانية الاستخدام في التطبيقات السريرية، والصيدلانية، وهندسة الأنسجة، وتطوير الأعضاء أو أشباه الأعضاء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بكفاءة إلى خلايا عضلة قلبية، وكيفية زيادة حجم المزرعة في مفاعل حيوي.