فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

الهدف العام من هذا الفحص اللوني هو فحص الإنزيمات المختلفة بتنسيق عالي الإنتاجية مقابل مجموعة مختارة من الركائز اللونية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف الإنزيم مثل إيجاد أنشطة إنزيم جديدة لتحلل الكتلة الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الركائز الملونة متوفرة بأربعة ألوان مختلفة مما يجعل هذه التقنية عالية الإنتاجية وموثوقة للغاية وفعالة من حيث التكلفة.

للبدء ، قم بتنشيط لوحة مجموعة فحص المرشح المكونة من 96 بئرا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة دون تحريض لمدة 10 دقائق. استخدم جهاز طرد مركزي وأي لوحة قياسية ذات 96 بئرا للتجميع.

لتدوير محلول التنشيط الموجود ، أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم إلى ركائز هيدروجيل البوليمر الكروموجينيك أو CPH وقم بتطبيق فراغ أو دوران لإزالة المثبت. كرر الغسيل مرتين أخريين. لتحضير تفاعل الإنزيم ، أضف 150 ميكرولترا من محلول أسيتات الصوديوم 100 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولترات من محلول السليولاز الداخلي بثلاثة تركيزات مختلفة لكل بئر من لوحة مجموعة الفحص.

ضع لوحة المنتج أسفل لوحة مجموعة الفحص لتجميع أي تسرب محتمل من لوحة التفاعل أثناء الاهتزاز. ثم قم باحتضان لوحة مجموعة الفحص في درجة حرارة الغرفة في شاكر أفقي عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. لتلقي بيانات موثوقة ، من الضروري تحريك خليط التفاعل أثناء الحضانة.

ضع لوحة مجموعة الفحص مع لوحة المنتج تحتها في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران لأسفل عند 2,700 × جم لمدة 10 دقائق. لنقل منتج التفاعل إلى آبار لوحة المنتج. بعد الدوران ، افحص لوحة المنتج بصريا للتحقق مما إذا كان حجم السائل في كل بئر متماثلا تقريبا.

باستخدام قارئ اللوحة ، اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 630 نانومتر لركائز CPH الخضراء المختلفة. تحليل البيانات ورسمها وفقا لبروتوكول النص. لإجراء الفحص الكروموجينيكي باستخدام الكتلة الحيوية الكروموجينية الحمراء غير القابلة للذوبان أو قش القمح ICB ، ابدأ بإضافة 200 ميكرولتر من محلول التنشيط في كل بئر من لوحة الفحص.

ثم احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المثبت باستخدام 100 ميكرولتر من الماء المعقم لغسل الآبار ثلاث مرات. ثم أضف 150 ميكرولترا من 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم الأس الهيدروجيني 4.5 و 5 ميكرولترات من 10 وحدات لكل مليلتر من محلول زيلاناز داخلي مختلف.

ضع لوحة المنتج أسفل لوحة الركيزة لتجميع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة أثناء الاهتزاز. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة عند 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، ضع لوحة مجموعة الفحص مع لوحة المنتج تحتها في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 2 ، 700 × جم لمدة 10 دقائق لنقل منتج التفاعل في آبار لوحة المنتج.

تأكد من أن حجم السائل في كل بئر متماثل تقريبا. بعد ذلك ، باستخدام قارئ الألواح ، اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 517 نانومتر لقش القمح ICB الأحمر. إجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.

يظهر هنا مثال على استجابة جرعة CPH-arabinoxylan إلى xylanase بتركيزات مختلفة من الإنزيم حيث يمكن ملاحظة انخفاض تركيز الإنزيم بصريا. يتم استخدام قياس كمي طيفي أكثر تفصيلا لرسم الامتصاص مقابل تركيز الإنزيم. مع كثافة الإشارة يماثل نشاط الإنزيم.

في هذا المثال من الاختبار المستخدم لفحص الإنزيم ، تم اختبار الخلية الداخلية بثلاثة تركيزات ضد ركائز CPH المختلفة. كما هو موضح هنا ، تم عرض نشاط إضافي للسيلولاز ل CPH-glucan و CPH-xylan و CPH-xyloglucan وشوهد نشاط منخفض ضد CPH-galactomannan. تم هضم نفس ركائز CPH باستخدام الإنزيمات المتاحة تجاريا المستخدمة كضوابط إيجابية في ظل نفس الظروف.

تظهر النتائج هنا أن جميع الركائز قد تحللت عند مستويات زادت مع زيادة تركيزات الإنزيم. في هذه التجربة ، تم تضمين خمس ركائز ICB مع 19 ركيزة CPH لتحليل الإنزيمات المفرزة من Phanerochaete chrysosporium في ظل ثلاثة ظروف مختلفة من الأس الهيدروجيني. أدت إنزيمات P.chrysosporium إلى تدهور العديد من الجلوكان والنشويات والزيلان.

يمكن الكشف عن إشارات أقل لنصف السليلوز أرابينان وجالاكتان البكتيك وكذلك ل RGI. كانت الإنزيمات المنتجة أكثر نشاطا في الظروف الحمضية منها في الظروف المحايدة أو الأساسية قليلا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعة واحدة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خلط التفاعل أثناء الحضانة. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفحص عالي الإنتاجية لاستكشاف أنشطة إنزيمية جديدة للتكنولوجيا الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجموعة الفحص.