فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم
سبتمبر 20, 2016
يتم وصف مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم. تتكون مجموعة الفحص الجاهزة للاستخدام متعددة الإرسال هذه من ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) المختارة مسبقا وركائز الكتلةB الهرومولينية Cالمعقدة I (ICB). الإنزيمات المستهدفة هي الإنزيمات الداخلية والبروتياز المتحلل للسكاريد.
الهدف العام من هذا الفحص اللوني هو فحص الإنزيمات المختلفة بتنسيق عالي الإنتاجية مقابل مجموعة مختارة من الركائز اللونية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف الإنزيم مثل إيجاد أنشطة إنزيم جديدة لتحلل الكتلة الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الركائز الملونة متوفرة بأربعة ألوان مختلفة مما يجعل هذه التقنية عالية الإنتاجية وموثوقة للغاية وفعالة من حيث التكلفة.
للبدء ، قم بتنشيط لوحة مجموعة فحص المرشح المكونة من 96 بئرا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول التنشيط لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة دون تحريض لمدة 10 دقائق. استخدم جهاز طرد مركزي وأي لوحة قياسية ذات 96 بئرا للتجميع.
لتدوير محلول التنشيط الموجود ، أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم إلى ركائز هيدروجيل البوليمر الكروموجينيك أو CPH وقم بتطبيق فراغ أو دوران لإزالة المثبت. كرر الغسيل مرتين أخريين. لتحضير تفاعل الإنزيم ، أضف 150 ميكرولترا من محلول أسيتات الصوديوم 100 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولترات من محلول السليولاز الداخلي بثلاثة تركيزات مختلفة لكل بئر من لوحة مجموعة الفحص.
ضع لوحة المنتج أسفل لوحة مجموعة الفحص لتجميع أي تسرب محتمل من لوحة التفاعل أثناء الاهتزاز. ثم قم باحتضان لوحة مجموعة الفحص في درجة حرارة الغرفة في شاكر أفقي عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. لتلقي بيانات موثوقة ، من الضروري تحريك خليط التفاعل أثناء الحضانة.
ضع لوحة مجموعة الفحص مع لوحة المنتج تحتها في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران لأسفل عند 2,700 × جم لمدة 10 دقائق. لنقل منتج التفاعل إلى آبار لوحة المنتج. بعد الدوران ، افحص لوحة المنتج بصريا للتحقق مما إذا كان حجم السائل في كل بئر متماثلا تقريبا.
باستخدام قارئ اللوحة ، اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 630 نانومتر لركائز CPH الخضراء المختلفة. تحليل البيانات ورسمها وفقا لبروتوكول النص. لإجراء الفحص الكروموجينيكي باستخدام الكتلة الحيوية الكروموجينية الحمراء غير القابلة للذوبان أو قش القمح ICB ، ابدأ بإضافة 200 ميكرولتر من محلول التنشيط في كل بئر من لوحة الفحص.
ثم احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المثبت باستخدام 100 ميكرولتر من الماء المعقم لغسل الآبار ثلاث مرات. ثم أضف 150 ميكرولترا من 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم الأس الهيدروجيني 4.5 و 5 ميكرولترات من 10 وحدات لكل مليلتر من محلول زيلاناز داخلي مختلف.
ضع لوحة المنتج أسفل لوحة الركيزة لتجميع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة أثناء الاهتزاز. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة عند 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، ضع لوحة مجموعة الفحص مع لوحة المنتج تحتها في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 2 ، 700 × جم لمدة 10 دقائق لنقل منتج التفاعل في آبار لوحة المنتج.
تأكد من أن حجم السائل في كل بئر متماثل تقريبا. بعد ذلك ، باستخدام قارئ الألواح ، اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 517 نانومتر لقش القمح ICB الأحمر. إجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.
يظهر هنا مثال على استجابة جرعة CPH-arabinoxylan إلى xylanase بتركيزات مختلفة من الإنزيم حيث يمكن ملاحظة انخفاض تركيز الإنزيم بصريا. يتم استخدام قياس كمي طيفي أكثر تفصيلا لرسم الامتصاص مقابل تركيز الإنزيم. مع كثافة الإشارة يماثل نشاط الإنزيم.
في هذا المثال من الاختبار المستخدم لفحص الإنزيم ، تم اختبار الخلية الداخلية بثلاثة تركيزات ضد ركائز CPH المختلفة. كما هو موضح هنا ، تم عرض نشاط إضافي للسيلولاز ل CPH-glucan و CPH-xylan و CPH-xyloglucan وشوهد نشاط منخفض ضد CPH-galactomannan. تم هضم نفس ركائز CPH باستخدام الإنزيمات المتاحة تجاريا المستخدمة كضوابط إيجابية في ظل نفس الظروف.
تظهر النتائج هنا أن جميع الركائز قد تحللت عند مستويات زادت مع زيادة تركيزات الإنزيم. في هذه التجربة ، تم تضمين خمس ركائز ICB مع 19 ركيزة CPH لتحليل الإنزيمات المفرزة من Phanerochaete chrysosporium في ظل ثلاثة ظروف مختلفة من الأس الهيدروجيني. أدت إنزيمات P.chrysosporium إلى تدهور العديد من الجلوكان والنشويات والزيلان.
يمكن الكشف عن إشارات أقل لنصف السليلوز أرابينان وجالاكتان البكتيك وكذلك ل RGI. كانت الإنزيمات المنتجة أكثر نشاطا في الظروف الحمضية منها في الظروف المحايدة أو الأساسية قليلا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعة واحدة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خلط التفاعل أثناء الحضانة. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفحص عالي الإنتاجية لاستكشاف أنشطة إنزيمية جديدة للتكنولوجيا الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجموعة الفحص.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة مقايسة لونية عالية الإنتاجية لفحص الإنزيمات باستخدام ركائز متعددة. تتضمن مجموعة المقايسة ركائز هيدروجيل بوليمر لوني (CPH) وكتلة حيوية لونية غير قابلة للذوبان (ICB) لاختبار الإنزيمات الداخلية المفككة للعديدات السكرية والبروتياز.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- فحص الإنزيمات
- التكنولوجيا الحيوية
- المقايسات عالية الإنتاجية
خلفية علمية
- يعد اكتشاف الإنزيمات أمراً بالغ الأهمية لمختلف التطبيقات، بما في ذلك تحلل الكتلة الحيوية.
- تسمح الركائز المولدة للألوان بالتتبع البصري لنشاط الإنزيم.
- تم تصميم هذا المقايسة لتكون موثوقة وفعالة من حيث التكلفة.
- توفر الركائز المختلفة مجموعة من الألوان لتحسين عملية التحليل.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لفحص الإنزيمات ضد ركائز متنوعة.
- تحديد أنشطة إنزيمية جديدة لتحلل الكتلة الحيوية.
- تسهيل عملية الفحص عالي الإنتاجية في أبحاث الإنزيمات.
الطرق المستخدمة
- تنشيط لوحة مجموعة مقايسة الترشيح ذات 96 بئراً باستخدام محلول تنشيط.
- حضن تفاعلات الإنزيم تحت ظروف مضبوطة.
- استخدام جهاز طرد مركزي لجمع النواتج.
- قياس الامتصاصية عند أطوال موجية محددة لتحليل البيانات.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة أنشطة الإنزيم لمجموعة متنوعة من ركائز CPH وICB.
- أدت التركيزات الإنزيمية الأعلى إلى زيادة تحلل الركيزة.
- أظهرت الركائز المختلفة مستويات متفاوتة من النشاط الإنزيمي.
- عززت الظروف الحمضية النشاط الإنزيمي مقارنة بالظروف المتعادلة أو القلوية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا المقايسة منصة قوية لفحص الإنزيمات.
- فهي تتيح للباحثين استكشاف أنشطة إنزيمية جديدة بكفاءة.
- ويسمح إتقان هذه التقنية بتنفيذها بسرعة في أقل من ساعة واحدة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تواجه عمليات فحص الإنزيمات عالية الإنتاجية عوائق تتعلق بتوفر الركائز وقابلية توسيع المقايسات، مما يحد من التوصيف الوظيفي السريع للإنزيمات النشطة كربوهيدراتياً (CAZymes) ذات الأهمية البالغة في التطبيقات الصناعية للوقود الحيوي والمنسوجات والأغذية. ويعالج هذا المقايس اللوني هذه الفجوة التقنية من خلال تمكين اختبار الركائز المتعددة والمرمزة بالألوان في تنسيق 96 بئراً، مما يعزز الثقة التنبؤية في المراحل المبكرة من اكتشاف الإنزيمات ويدعم قرارات المتابعة أو الإيقاف في مسارات هندسة الإنزيمات. كما تعزز هذه الطريقة الاستمرارية الانتقالية من تحديد الهدف إلى التحقق الشبيه بالمرحلة قبل السريرية من خلال توفير قراءات نشاط كمية وقابلة للتكرار عبر ركائز متنوعة من السكريات المتعددة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح الاستقصاء الوظيفي لإنزيمات CAZymes المفترضة من خلال ربط المرشحات الجينية بالنشاط البيوكيميائي على ركائز متعددة السكريات محددة.
- القيمة التشغيلية: تدعم الاختبار السريع للفرضيات من خلال ركائز CPH متعددة الألوان، مما يزيد من إنتاجية الفحص دون المساس بموثوقية البيانات.
- القيمة التنبؤية: تسهل تقليل المخاطر الميكانيكية عن طريق قياس نشاط الإنزيم المعتمد على الجرعة، مما يساعد في تحديد أولويات الأهداف لتطوير الإنزيمات الصناعية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر ركائز مولدة للألوان غير قابلة للذوبان ومعيارية (CPH و ICB) تحاكي الكتلة الحيوية المعقدة، مما يتيح إجراء تقييمات للنشاط ذات صلة فسيولوجية.
- القيمة التشغيلية: يضمن تكرارية المقايسة من خلال خطوات معيارية للتنشيط والغسيل والطرد المركزي، مما يقلل من التباين في سير العمل عالي الإنتاجية.
- قيمة القابلية للتوسع: يتوافق مع أجهزة قراءة الأطباق المعيارية ذات 96 بئراً وأنظمة مناولة السوائل، مما يسمح بدمجه في منصات الفحص الحالية لتقييم مزيج الإنزيمات أو المرق.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم نمذجة الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال اختبار نشاط الإنزيم تحت ظروف pH متنوعة، مما يعكس بيئات العمليات الصناعية.
- القيمة التشغيلية: يتيح اتخاذ قرارات تقدم مدروسة بناءً على المخاطر من خلال ربط تركيز الإنزيم بتحلل الركيزة عبر أنواع متعددة من الكتلة الحيوية (على سبيل المثال، قش القمح، والجلوكانات، والزيلانات).
- القيمة التنبؤية: يعزز مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال تحديد أنماط النشاط المعتمدة على pH، وهي أنماط ضرورية لاستقرار التركيبة في تطبيقات المنظفات أو الوقود الحيوي.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج هذا المقايسة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف المبكر إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يدعم اختبار الفرضيات، وتوضيح المسارات، وتقليل المخاطر البيولوجية للإنزيمات المفككة للكربوهيدرات قبل الاستثمار في هندسة البروتينات أو توسيع نطاق التخمير.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح توضيح المسارات من خلال فحص نشاط الإنزيم مقابل ركائز متعددة السكريد محددة (على سبيل المثال، CPH-glucan وCPH-xylan) لاستنتاج خصوصية الركيزة والدور الوظيفي.
- الفحص: توفر جاهزية المقايسة ومخرجات كمية عبر قياسات الامتصاص عند 630 nm (CPH) و517 nm (ICB)، مما يسمح بمقارنة موثوقة بين متغيرات الإنزيمات أو الظروف المختلفة.
- التحليلات: توفر بيانات الاستجابة للجرعة التي تدعم التحليل الإحصائي واختيار النتائج الإيجابية، مما يساعد الفرق على ترتيب المرشحين من الإنزيمات حسب النشاط والخصوصية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط مرحلة الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تقييم أداء الإنزيم تحت ظروف ذات صلة بالصناعة (على سبيل المثال، pH حمضي، ركائز الكتلة الحيوية المعقدة).
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص مكتبات الإنزيمات، أو المرق، أو مجموعات الإنزيمات عبر مشاريع متعددة في الصناعات القائمة على الأساس الحيوي.
التأثير التشغيلي وعلى مستوى المؤسسة
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الإيجابيات الكاذبة عن طريق القياس المباشر للنشاط على ركائز غير ذائبة وشبيهة بالحالة الطبيعية.
- القيمة التشغيلية: توفر التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال تحديد أحجام الكواشف، وأوقات الحضن، ومعايير الطرد المركزي، مما يقلل من التباين المعتمد على المستخدم.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الفحص السريع لمئات من الإنزيمات المرشحة، مما يقلل من الوقت والتكلفة المرتبطين بالمقاييس البيوكيميائية ذات الإنتاجية المنخفضة.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توليد بيانات نشاط كمية توجه قرارات الاستمرار أو التوقف في حملات هندسة الإنزيمات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في حركية الإنزيمات وتحسين المقايسات اللونية لضمان التحضير الدقيق للركيزة ومراقبة التفاعل.
- يعتمد على توفر قارئ أطباق قادر على قياس الامتصاصية عند 630 nm و 517 nm، وجهاز طرد مركزي متوافق مع الأطباق ذات 96 بئراً لنقل المنتج.
- يستلزم توحيداً قياسياً بين الفرق لظروف المنظم (مثل sodium acetate pH 4.5) ومعايير الحضن (مثل الرج بسرعة 100 rpm) لضمان قابلية تكرار النتائج عبر المواقع المختلفة.
- يتضمن اعتبارات الموائمة عند اختبار ركائز غير متعددة السكريات، حيث إن المقايسة مُحسّنة للإنزيمات النشطة كربوهيدراتياً وقد تتطلب تعديلات في المنظم أو الركيزة لفئات الإنزيمات الأخرى.
- يشمل قيوداً عملية مثل ضرورة تجنب الرج أثناء خطوات التنشيط والاستقرار، والتأكيد البصري على تساوي حجم المنتج بعد الطرد المركزي لضمان تفسير موثوق للبيانات.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
