التصحيح تسجيلات المشبك على سليمة الظهرية جذر العقد من الجرذان الكبار

الهدف العام لهذه التجربة هو إدخال طرق لتحضير العقد الجذرية الظهرية السليمة وإجراء تسجيل مشبك التصحيح باستخدام هذا المستحضر. تسمح هذه الطريقة بتسجيل خلية واحدة من العقد الجذرية الظهرية السليمة مع تحفيز العصب الشوكي الوارد أو الجذر الظهري الخارج. هذا النهج مفيد بشكل خاص عند دراسة مساهمة الخلايا العصبية الحسية الأولية في الألم.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحافظ على كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المجاورة للأقمار الصناعية. لذلك ، هذا المستحضر أقرب إلى الوضع الحي. في هذا الإجراء ، بعد تخدير الفئران ، حلق منطقة أسفل الظهر.

ثم شق الجلد والأنسجة تحت الجلد على طول خط الوسط. بعد ذلك ، افصل العضلات حول العمود الفقري عن العمليات الشوكية على المستوى L1 إلى S2 باستخدام مصعد السمحاق الناعم. بعد ذلك ، قم بقطع العمليات الشائكة من L1 إلى S2. بعد ذلك ، قم بعمل قطعتين عرضيتين في العمود الفقري المكشوف عند حوالي L1 و S1 وقم بإزالة هذا الجزء من العمود الفقري en كتلة.

ثم اغمره بسرعة في aCSF البارد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك ، اغسل الدم من العمود الفقري الذي تمت إزالته وانقل العمود الفقري إلى طبق بتري مع aCSF بارد ، ثم استخدم rongeur ناعما لإزالة الصفائح. قطع الأم الجافية على طول خط الوسط باستخدام مقص دقيق لفضح الحبل الشوكي.

بعد ذلك ، انقل الفقرة المتبقية مع DRG إلى طبق بتري الثاني المليء ب aCSF البارد. حدد L4 و L5 DRGs بناء على موقعها النسبي للعمليات المستعرضة والعصب الوركي. بعد ذلك ، حرر DRG من الأنسجة الضامة المحيطة وحافظ على جذر العصب والعصب الشوكي مرتبطين ب DRG.

بعد ذلك ، انقل DRG إلى طبق بتري الثالث لمزيد من التشريح. قم بقطع فتحة حيث تنضم الجذور الظهرية والبطنية إلى DRG وتفصل الجذر البطني عنها. بعد ذلك ، استخدم ملقطا بأطراف حادة لتثبيت epineurium واستخدم ملقطا دقيقا آخر لدحرجة DRG من epineurium.

استمر في إزالة أكبر قدر ممكن من epineurium المتصل ب DRG. الآن ، انقل DRG إلى غرفة التسجيل. تأكد من أن جانب DRG حيث تنشأ جذور الأعصاب موجه لأسفل.

بعد ذلك ، قم بتثبيت DRG باستخدام مرساة. بعد ذلك ، قم ببث DRG باستخدام aCSF المؤكسج من خلال الأنابيب البلاستيكية المتصلة بمضخة تمعجية والسماح للخلايا بالتعافي لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بتقييم جودة DRG تحت بصريات IR-DIC بتكبير 40x من خلال كاميرا CCD.

يتم توصيل حقنتين سعة مليلتر واحد بشكل فردي بحاملي الماصات من خلال قطعتين من الأنابيب المطاطية ذات القطر الصغير. بعد ذلك، ضع ماصة زجاجية مملوءة بالكولاجيناز في أحد حاملات الماصات وماصة زجاجية فارغة في الأخرى. بعد ذلك، استخدم المعالج الدقيق لوضع الماصات فوق DRG مباشرة.

اصطدم أطراف ماصتين ببعضهما البعض برفق لتكبير فتحات أطراف الماصة. بعد ذلك، حرك الماصة المملوءة بالكولاجيناز بالقرب من سطح DRG. قم بالضغط الإيجابي لفترة وجيزة على الماصة التي تحتوي على الكولاجيناز من خلال الأنبوب الذي يربط الحامل والحقنة عن طريق إزاحة المكبس حوالي 0.5 ملليلتر.

بعد 10 إلى 15 دقيقة ، عندما يلاحظ بقايا الخلف المتبقي ، استخدم ضغطا سلبيا لطيفا على الماصة الفارغة لامتصاص الحطام. بهذه الطريقة ، ستكون الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المحيطة بالأقمار الصناعية المحيطة بها مكشوفة بوضوح وجاهزة لتسجيل التصحيح. في هذا الإجراء ، ضع محلول القطب الكهربائي على الجليد لمنع التدهور.

بعد ذلك ، املأ الماصة الزجاجية بمحلول مفلتر داخل الخلايا. بعد ذلك، ضع الماصة في حامل الماصة في مرحلة الرأس. ضع ضغطا إيجابيا لطيفا على الماصة من خلال حقنة سعة خمسة ملليلتر عن طريق إزاحة المكبس حوالي ملليلتر واحد قبل خفض الماصة في محلول الحمام.

بعد ذلك ، اختر وضع V-Clamp على مكبر الصوت وافتح واجهة اختبار الغشاء في البرنامج. تحت المجهر ، حرك الماصة بالقرب من الخلية العصبية المستهدفة. بعد ذلك ، قم بالضغط الإيجابي من الماصة لاجتياز طبقة الخلايا الدبقية عبر القمر الصناعي حتى يتم ملاحظة تضخم مفاجئ في المساحة بين الخلايا العصبية والطبقة المحيطة بها من الخلايا الدبقية عبر الأقمار الصناعية.

بعد ذلك ، استمر في تحريك الماصة نحو الخلايا العصبية حتى يتم ملاحظة غمازة على الخلايا العصبية. في تحضيرنا ، تحيط الخلايا العصبية بخلايا دبقية الأقمار الصناعية. لذلك ، لاختراق طبقات الخلايا الدبقية والوصول إلى الخلايا العصبية الفردية ، يتم الحفاظ على ماصة التسجيل عند ضغط إيجابي مرتفع.

بعد ذلك ، قلل الضغط الإيجابي. احصل على ختم جيجا أوم بشفط لطيف. للحصول على تكوين تسجيل الخلية الكاملة ، اخترق غشاء الخلية العصبية عن طريق شفط قصير ولكنه قوي.

بدلا من ذلك ، استخدم وظيفة الانطلاق على مكبر الصوت أثناء تطبيق الشفط. بمجرد إنشاء وضع الخلية بالكامل ، قم بتعويض سعة الخلية بالكامل ومقاومة السلسلة عن طريق تدوير مقابض تعويض السعة والمقاومة على مكبر الصوت. ثم أغلق نافذة اختبار الغشاء.

اختر I-Clamp Normal Mode عن طريق تدوير مقبض الوضع على مكبر الصوت. بعد ذلك ، انقر فوق فتح البروتوكول في البرنامج. حدد وقم بتحميل البروتوكول لقياس قاعدة متغيرة وانقر فوق التسجيل لبدء التسجيل.

لفحص استثارة الخلايا العصبية ، قم بقياس مقاومة الإدخال والقاعدة الريوية عن طريق حقن سلسلة متدرجة من تيارات إزالة الاستقطاب في خطوات من 100 بيكوأمبير. بعد ذلك ، انقر فوق فتح البروتوكول مرة أخرى وحدد بروتوكول قياس عتبة الغشاء. بعد ذلك ، قم بحقن تيار منحدر لإزالة الاستقطاب بسعة 500 مللي ثانية إلى الخلايا العصبية.

لتسجيل التيارات التي يسببها الترابط ، املأ ماصة بناهضات محددة. افحص الماصة للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء بالداخل. بعد ذلك، ضع الماصة في حامل الماصة المتصل بنظام توزيع الأدوية.

استخدم المعالج لتحريك الماصة إلى مسافة 15 ميكرومتر من الخلية العصبية. اضبط ضغط نظام صرف الدواء على رطل لكل بوصة مربعة واحدة والمدة على ثانية واحدة. بعد ذلك ، قم بتبديل وضع التسجيل إلى مشبك الجهد عند 70 مللي فولت.

اضغط لفترة وجيزة عبر نظام صرف الدواء لتسجيل التيار المستحث عن الدواء. في هذا الشكل ، تم قياس قاعدة الريوباز عن طريق حقن سلسلة من التيارات في الخلايا العصبية DRG. يتم تعريف أدنى شدة تيار يمكن أن تحفز جهد الفعل على أنها قاعدة متغيرة ، كما هو موضح بالسهم.

القاعدة الريوبازية لهذه الخلايا العصبية هي 300 بيكوأمبير. تم قياس عتبة الغشاء عن طريق حقن تيار منحدر. يتم تعريف الإمكانات على أنها عتبة الغشاء عند استحضار جهد الفعل.

عتبة الغشاء لهذه الخلايا العصبية هي 11.9 مللي فولت. في هذا الشكل ، تم تحفيز التيارات عن طريق تطبيق الغلوتامات أو AITC لمدة ثانية واحدة. تسبب كلا الناهضين في حدوث تيارات داخلية ، مما يشير إلى وجود مستقبلات الغلوتامات ومستقبلات TRPA-1 على الخلايا العصبية DRG الصغيرة.

بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه التقنية في غضون ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة epineurium والحفاظ على الضغط العالي لماصة التسجيل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تسجيل مشبك التصحيح على الخلايا الدبقية عبر الأقمار الصناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل المستقبلات والقنوات في الخلايا الدبقية عبر الأقمار الصناعية.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الألم لدراسة مساهمة العقد الجذرية الظهرية في الشعور بالألم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عقد الجذر الظهري الكامل ثم كيفية تصحيح المشبك من الخلايا المفردة على هذه العقد الجذرية الظهرية بأكملها.