عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

الهدف العام من طريقة FINA هذه ، والتي تعني عزل الترشيح للأحماض النووية ، هو عزل الحمض النووي الجيني لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من العينات المعقدة بسرعة وبساطة دون استخدام الأجهزة المختبرية مثل أجهزة الطرد المركزي. تم تطوير طريقة استخراج الحمض النووي السريعة القائمة على الورق للحمض النووي الفيروسي المؤيد لفيروس نقص المناعة البشرية لدمجها في جهاز تشخيص PCR الكمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحضير وحدات إعداد العينة وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل مسبقا بحيث يستغرق استخراج الحمض النووي أقل من دقيقتين.

قمنا أولا بتطوير هذه الطريقة ليتم دمجها في عينة للإجابة على الاختبار التشخيصي المبكر للرضع لفيروس نقص المناعة البشرية -1 من دم عصا الكعب. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إزالة دعامة الشريط المزدوج الوجهين الذي يثبت غشاء التقاط الخلية على جانب أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل يتطلب ممارسة. سيوضح الإجراء جين ريد ، وهو فني أول من مختبري.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد المواد اللازمة لتجميع وحدة تحضير عينة FINA. قم بإعداد وسادة النشاف عن طريق قطع وسادة قطنية بسمك 2.6 مم 100٪ بسمك 35 ملليمتر. تحضير فيلم البارافين البلاستيكي بشريط دعم ورقي.

قم بقص قطعة من فيلم البارافين مقاس 25 × 50 مم ثم استخدم مطرقة لعمل ثقب قطره 7.14 مم في وسط الشريط. قم بإعداد غشاء فاصل الدم الزجاجي المرتبط أو قرص الالتقاط باستخدام مطرقة لكمة دائرة قطرها 8.35 مم. لتجميع وحدة تحضير العينة FINA ، استخدم الملقط لوضع قرص الالتقاط في وسط وسادة النشاف.

قم بإزالة الجزء الخلفي من شريط فيلم البارافين وضعه فوق قرص الالتقاط بحيث يترك شريط البارافين بالكامل مركز قرص الالتقاط مكشوفا. تأكد من أقصى قدر من التلامس بين القرص ولوحة النشاف عن طريق مد شريط البارافين قليلا لتغطية وسادة النشاف والضغط على شريط البارافين بإحكام لتثبيته على وسادة النشاف حول جميع حواف القرص. مطلوب قرص شريطي مقاس 5.1 مم لتثبيت غشاء الالتقاط على جانب أنبوب qPCR لمنع الغشاء من منع الكشف عن التألق لأداة PCR في الوقت الفعلي.

قم بإعداد قرص الشريط هذا باستخدام مطرقة لكمة دائرة من شريط تشخيص البوليستر المطلي المزدوج من ورقة الشريط. باستخدام الملقط ، قم بإزالة جانب واحد من بطانة ملصق الشريط. ضع الشريط في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر ، وألصقه على جانب واحد وباتجاه أسفل الأنبوب.

قم بإزالة بطانة الملصق الثانية. الأنبوب جاهز الآن لاستقبال القرص المعد. سيتم توضيح اكتشاف الحمض النووي الفيروسي من الدم الكامل المليء بخلايا 8e5 LAV في هذا الفيديو.

قم بإذابة كريات خلايا 8e5 LAV المجمدة مسبقا على الجليد. قم بإعداد تخفيف تسلسلي للخلايا في وسط التجميد بتركيزات تتراوح من 1 إلى 400 خلية لكل ميكرولتر. ماصة 10 ميكرولتر من الخلايا من كل من التخفيفات إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

أضف 100 ميكرولتر من عينة الدم الكاملة الطازجة المعالجة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 سلبية إلى كل أنبوب لإنشاء منحنى قياسي. امزج عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب خمس مرات. لبدء إجراء استخراج الحمض النووي ، قم بتحلل خلايا الدم عن طريق إضافة triton X-100 إلى تركيز نهائي قدره واحد بالمائة.

امزج عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب خمس مرات. يجب أن يتحول لون الدم إلى اللون الأحمر الشفاف. ماصة عينة الدم بأكملها على قرص الالتقاط.

الختم المحكم للماء بين شريط البارافين وغشاء الالتقاط تدفق الدم عبر الغشاء. ويضمن الاتصال الجيد بين غشاء التلامس ومجموعة وسادة النشاف فتل العينة بسرعة. اسمح للعينة بالنقع في الفلتر.

تم نقع محلول الدم في قرص الالتقاط ويظهر القرص حصيرة. أضف 600 إلى 1 ، 000 ميكرولتر من 10 مليمول هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط على قرص الالتقاط. سيتغير الفلتر من الأحمر إلى الأبيض ، مما يشير إلى إزالة الهيموجلوبين.

بعد ذلك ، افصل القرص عن وسادة النشاف وقم بتطبيق القرص على الشريط الموجود في أنبوب PCR المجهز. بعد وضع المرشح في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتحليل العينة على الفور. قم بإعداد مزيج qPCR الرئيسي كما هو موضح في نص البروتوكول وتأكد من أن المرشح مغطى بالكامل بالمزيج الرئيسي ويظل ثابتا على جانب الأنبوب طوال التفاعل.

قم بإجراء التضخيم باستخدام جهاز PCR في الوقت الفعلي كما هو موضح في نص البروتوكول. بدلا من ذلك ، إذا تعذر إجراء qPCR ، جفف الفلتر على الفور طوال الليل في صندوق يحتوي على مجفف كبريتات الكالسيوم. في اليوم التالي ، قم بتغطية أنبوب PCR وضعه في كيس محبط به مجفف السيليكا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح جاهزا للتحليل.

تسمح هذه الطريقة بالتضخيم الفعال للفيروس الأولي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 من خلايا 8e5 LAV بأرقام نسخ مختلفة. الخطوط الصلبة عبارة عن مخططات تضخيم تم الحصول عليها من أربع نسخ مكررة من الدم الكامل السلبي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 مع 4 ، 000 ، 400 ، 40 و 10 8e5 خلايا LAV مع 500 نسخة لكل تفاعل من التحكم الداخلي. يشير الخط المنقط إلى الحد.

يوضح هذا الرسم البياني التالي المنحنيات القياسية لقيم دورة القياس الكمي المحسوبة من مخطط التضخيم vs. log عدد نسخ 8e5 خلايا LAV لكل 100 ميكرولتر من الدم الكامل. كانت كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل المحسوبة 103٪ ، كما أن منحنى الحمض النووي القياسي للفيروسات لفيروس نقص المناعة البشرية لها تضخيم قابل للتكرار بدرجة كبيرة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود تحكم داخلي ل 500 نسخة من اختزال هيدروكسي بيروفات يظهر أنه لا يوجد تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل ناتج عن استخراج الدم بهذه الطريقة بشكل مستقل عن عدد نسخ فيروس HIV-1 الموجودة. تمثل الخطوط المتصلة مخططات التضخيم ويمثل الخط المنقط العتبة. بعد هذا الإجراء ، يمكن تضخيم أهداف تفاعل البوليميراز المتسلسل من أنواع مختلفة من العينات للكشف عن الجين الذي تهمك.

على سبيل المثال مسحات الخد للفحص الوراثي الدوائي أو الدم للتنميط الجيني السريع للنماذج الحيوانية. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض المنقولة بالدم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات الشاملة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.