عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

يتمثل الهدف العام من طريقة FINA، والتي ترمز إلى عزل الأحماض النووية عن طريق الترشيح، في عزل الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) من أجل تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من عينات معقدة بشكل سريع وبسيط دون الحاجة إلى استخدام أجهزة مختبرية مثل جهاز الطرد المركزي. وقد تم تطوير طريقة استخلاص الحمض النووي السريعة القائمة على الورق هذه والمخصصة للحمض النووي الفيروسي المدمج (pro viral DNA) لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) لدمجها في جهاز تشخيصي يعمل بتقنية PCR الكمي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تحضير وحدات تجهيز العينات وأنابيب PCR مسبقاً، بحيث تستغرق عملية استخلاص الحمض النووي أقل من دقيقتين.

لقد قمنا أولاً بتطوير هذه الطريقة لدمجها في عينة تهدف للإجابة على اختبار تشخيصي مبكر للرضع المصابين بفيروس HIV-1 من دم مأخوذ من وخزة الكعب. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبة لأن إزالة الغطاء الخلفي للشريط اللاصق مزدوج الوجه الذي يثبت غشاء التقاط الخلايا بجانب أنبوب PCR تتطلب ممارسة. وستقوم جين ريد، وهي فنية أولى من مختبري، بشرح هذا الإجراء.

ابدأ هذا الإجراء بتحضير المواد اللازمة لتجميع وحدة تحضير عينات FINA. قم بتجهيز وسادة الامتصاص عن طريق قص مربع بمقاس 35 في 35 مليمتر من وسادة قطنية 100% بسمك 2.6 مليمتر. جهز فيلم البارافين البلاستيكي مع شريط لاصق مدعوم بالورق.

قُم بقص قطعة من فيلم البارافين بمقاس 25 by 50 mm، ثم استخدم مِثقابًا يدويًا لعمل ثقب بقطر 7.14 mm في مركز الشريط. جَهِّز غشاءً زجاجيًا لفصل الدم أو قرص التقاط عن طريق استخدام مِثقاب يدوي لقص دائرة بقطر 8.35 mm. ولتجميع وحدة تحضير العينات FINA، استخدم ملقطًا لوضع قرص التقاط في مركز وسادة التلطيخ.

قم بإزالة الغطاء الخلفي لشريط فيلم البارافين وضعه فوق قرص الالتقاط بحيث يظل مركز قرص الالتقاط مكشوفاً بالكامل من شريط البارافين. تأكد من تحقيق أقصى تلامس بين القرص ووسادة اللطخة عن طريق شد شريط البارافين قليلاً لتغطية وسادة اللطخة والضغط عليه بقوة لإلصاقه بوسادة اللطخة حول جميع حواف القرص. يتطلب الأمر استخدام قرص شريط بقطر 5.1 mm لتثبيت غشاء الالتقاط في جانب أنبوب qPCR لمنع الغشاء من إعاقة الكشف عن الفلورة في جهاز الـ real time PCR.

قم بتجهيز قرص الشريط هذا باستخدام مطرقة لثقب دائرة من شريط تشخيصي بوليستر مزدوج الطلاء من ورقة الشريط. وباستخدام الملقط، قم بإزالة أحد جانبي بطانة ملصق الشريط. ضع الشريط في أنبوب PCR سعة 200 microliter، وألصقه على أحد جوانب الأنبوب وباتجاه القاع.

قم بإزالة بطانة الملصق الثانية. أصبح الأنبوب الآن جاهزاً لاستقبال القرص المُحضّر. سيتم في هذا الفيديو توضيح الكشف عن الحمض النووي للفيروسات المدمجة (proviral DNA) من دم كامل مُدعم بـ 8e5 من خلايا LAV.

قم بإذابة كتل خلايا LAV المجمدة مسبقاً (8e5) على الثلج. قم بتحضير تخفيف متسلسل للخلايا في وسط التجميد بتركيزات تتراوح من 1 إلى 400 خلية لكل ميكرولتر. انقل 10 µL من الخلايا من كل تخفيف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

أضف 100 µL من عينة دم كاملة حديثة ومعالجة بـ eDTA وسلبية لفيروس HIV-1 إلى كل أنبوب لإنشاء منحنى قياسي. اخلط العينة عن طريق نقر الجزء السفلي من الأنبوب برفق خمس مرات. لبدء إجراء استخلاص DNA، قم بتحليل خلايا الدم عن طريق إضافة triton X-100 ليصل التركيز النهائي إلى 1%.

امزج المحلول عن طريق نقر قاع الأنبوب برفق خمس مرات. يجب أن يتحول الدم إلى اللون الأحمر الشفاف. انقل عينة الدم كاملة باستخدام الماصة إلى قرص الالتقاط.

يضمن الختم المحكم للمياه بين شريط البارافين وغشاء الالتقاط تدفق الدم عبر الغشاء. كما يضمن التلامس الجيد بين غشاء التلامس ومجموعة وسادات الامتصاص سحب العينة بسرعة. اترك العينة تتشرب عبر المرشح.

لقد تشرب قرص الالتقاط محلل الدم وأصبح مظهر القرص مطفيًا. أضف من 600 إلى 1,000 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 10 mmol قطرة تلو الأخرى على قرص الالتقاط. سيتغير لون المرشح من الأحمر إلى الأبيض، مما يشير إلى التخلص من الهيموجلوبين.

بعد ذلك، افصل القرص عن وسادة الامتصاص وثبّت القرص على الشريط الموجود في أنبوب PCR المجهز. وبمجرد وضع المرشح في أنبوب PCR، قم بتحليل العينة على الفور. جهّز المزيج الرئيسي لـ qPCR كما هو موضح في نص البروتوكول، وتأكد من أن المزيج الرئيسي يغطي المرشح بالكامل وأن المرشح يظل ثابتًا على جانب الأنبوب طوال فترة التفاعل.

قم بإجراء التضخيم باستخدام جهاز PCR في الوقت الحقيقي كما هو موضح في نص البروتوكول. بدلاً من ذلك، إذا تعذر إجراء qPCR على الفور، قم بتجفيف المرشح طوال الليل في صندوق يحتوي على مجفف كبريتات الكالسيوم. وفي اليوم التالي، أغلق أنبوبة PCR بغطائها وضعها في كيس من القصدير يحتوي على مجفف السيليكا، واحفظها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للتحليل.

تسمح هذه الطريقة بالتضخيم الفعال للفيروس المدمج HIV-1 من خلايا 8e5 LAV بأعداد نسخ مختلفة. تمثل الخطوط المتصلة مخططات التضخيم التي تم الحصول عليها من أربع مكررات من دم كامل سلبي لـ HIV-1 تم تدعيمه بـ 4,000 و 400 و 40 و 10 من خلايا 8e5 LAV مع 500 نسخة لكل تفاعل من الضابط الداخلي. ويشير الخط المنقط إلى عتبة الكشف.

يوضح الرسم البياني التالي منحنيات قياسية لقيم دورات التكميم المحسوبة من مخطط التضخيم مقابل لوغاريتم عدد النسخ لـ 8e5 من خلايا LAV لكل 100 µL من الدم الكامل. وقد بلغت كفاءة PCR المحسوبة 103%، كما أظهرت مكررات المنحنى القياسي للحمض النووي الاستباقي للفيروس HIV تضخيماً قابلاً للتكرار بدرجة عالية.

بالإضافة إلى ذلك، فإن وجود ضابط داخلي مكون من 500 نسخة من hydroxy pyruvate reductase يظهر عدم وجود تثبيط لتفاعل PCR ناتج عن استخلاص الدم بهذه الطريقة، وبصرف النظر عن عدد نسخ provirus الخاص بفيروس HIV-1 الموجودة. تمثل الخطوط المتصلة مخططات التضخيم، بينما يمثل الخط المتقطع العتبة. باتباع هذا الإجراء، يمكن تضخيم أهداف PCR من أنواع مختلفة من العينات للكشف عن الجين المستهدف.

على سبيل المثال، مسحات باطن الخد للفحص الدوائي الجيني أو الدم للتنميط الجيني السريع للنماذج الحيوانية. لا تنسَ أن العمل مع الممرضات المنقولة عن طريق الدم قد يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات العامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.