التصوير نيون المشتركة القريبة من تحت الحمراء والتصوير المقطعي مايكرو لتصور مباشرة الشلل Thromboemboli

الهدف العام من تقنية تصوير الخثرة المباشرة هذه هو التصوير الكمي للخثرات الانصمامية الدماغية الموصومة فلورياً في الجسم الحي (in vivo) وخارجه (ex vivo)، وذلك باستخدام جسيمات الذهب النانوية، والتصوير المقطعي المحوسب، والتصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الإرقاء والتخثر، مثل الاستجابة العظمية الشديدة للخثرات الانصمامية الدماغية تجاه منشط البلازمينوجين النسيجي أو عوامل إذابة الخثرات الجديدة قيد البحث، وذلك بناءً على الجرعة أو الوقت. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه بعد الحقن الوريدي لجسيمات الذهب النانوية، يتيح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) عالي الدقة رصد التطور الديناميكي للخثرات الانصمامية الدماغية من خلال تصوير مواقعها وحملها كمياً في الجسم الحي، ثم تأكيد ذلك عن طريق التصوير الفلوري للخثرة بالأشعة تحت الحمراء القريبة خارج الجسم.

سيقوم Jeong-Yeon Kim، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح الإجراء. بعد جمع 300 إلى 1,000 µL من الدم الشرياني عن طريق ثقب القلب، أضف 70 µL من العينة إلى 30 µL من عامل التجلط المنشط المناسب، ومجس فلوري حساس لنشاط الربط المتصالب للفبرين بوساطة العامل 13، ثم املأ محقنة سعة 3 mL، مزودة بإبرة مقاس 23 gauge، بالمزيج الناتج. بعد ذلك، احقن الدم المسمى في أنبوب بولي إيثيلين بطول 20 cm واترك الدم يتجلط في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور ساعتين، انقل الأنبوب إلى درجة حرارة 4 °C لمدة 22 ساعة، ثم قطع الأنبوب إلى قطع بطول 1.5 سم. باستخدام محقنة سعة 3 مل مملوءة بمحلول PBS، ادفع الخثرة من كل قطعة من الأنابيب إلى آبار منفصلة في طبق سداسي الآبار يحتوي على محلول PBS. اغسل الخثرات ثلاث مرات بمحلول PBS، ثم أدخل محقنة سعة 1 مل مملوءة بمحلول ملحي ومجهزة بإبرة قياس 30 gauge في أحد طرفي أنبوب PE10 بطول 15 سم، واسحب بعناية خثرة واحدة مغسولة إلى الطرف المقابل من الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب PE10 المحمل بالجلطة الدموية بأنبوب PE50 بطول ثلاثة سنتيمترات وبنهاية مستدقة بقطر 200 ميكرون. بعد التأكد من التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم، قم بتطهير المنطقة الجراحية باستخدام Betadine وكحول 70%، واستخدم مشرطاً لإجراء شق رأسي بطول واحد سنتيمتر بين الأذن والعين اليسرى. قم بلصق الطرف البعيد للألياف الضوئية الخاصة بمقياس تدفق ليزر دوبلر (laser Doppler flow meter) على سطح العظم الصدغي الأيسر المكشوف، على مسافة واحد مليمتر إلى اليسار وأربعة مليمترات أسفل منطقة bregma، ثم ابدأ بمراقبة دوبلر.

ثم قم بإجراء شق عمودي في خط المنتصف بطول ثلاثة سنتيمترات عبر الأنسجة الرخوة المحيطة بالأوعية الدموية للكشف عن منطقة البصلة السباتية اليسرى. وباستخدام خيط جراحي من الحرير الأسود 6-0 معقم، قم بربط الشريان السباتي المشترك القريب الأيسر، يليه ربط الشريان السباتي الداخلي الأيسر والشريان الحنكي الحنكي الأيسر باستخدام خيوط جراحية من الحرير الأسود 7-0 معقمة. وباستخدام كي كهربائي أحادي القطب، قم بكي الشريان الدرقي العلوي الأيسر، ثم استخدم خيوطاً جراحية من الحرير الأسود 7-0 معقمة لربط الشريان السباتي الخارجي القريب الأيسر ربطاً رخواً، وربط الطرف القاصي للوعاء الدموي ربطاً محكماً.

استخدم مقصات دقيقة لعمل ثقب يتراوح قطره بين 0.2 إلى 0.25 ميكرون بين مواقع الربط في الشريان السباتي الخارجي، ثم أدخل القسطرة التي تحتوي على الخثرة في الثقب مع إرخاء رباط الشريان السباتي الخارجي الداني. قم بدفع القسطرة إلى داخل الشريان السباتي المشترك لتثبيتها في مكانها، ثم أعد إحكام رباط الشريان السباتي الخارجي الداني. اقطع الطرف القاصي للشريان السباتي الخارجي باستخدام الكي، وقم بتدوير الطرف الداني الحر للشريان السباتي الخارجي في اتجاه عقارب الساعة لمحاذاة الوعاء مع الشريان السباتي الداخلي أثناء سحب القسطرة.

بعد ذلك، قم بإرخاء رباط الشريان السباتي الداخلي وقم على الفور بدفع القسطرة حوالي تسعة مليمترات وصولاً إلى تفرع الشريان المخي الأوسط والشريان المخي الأمامي. الآن، أعد إحكام غرزة الشريان السباتي الداخلي حول القسطرة واضغط برفق على المحقنة لحقن الخثرة في منطقة التفرع. إذا لوحظ تدفق دم في جهاز Doppler يكون أقل من أو يساوي 30% مقارنة بخط الأساس، فقم بإزالة القسطرة واربط على الفور الطرف القريب من الشريان السباتي الخارجي.

لتصوير الخثرة بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في النقطة الزمنية التجريبية المناسبة، قم بتخفيف الجسيمات النانوية الذهبية المستهدفة للفبرين إلى تركيز 10 mg/mL في محلول PBS بتركيز 10 mM، ثم قم بمعالجة عامل تصوير الخثرة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة لضمان تعليق متجانس للجسيمات النانوية. بعد ذلك، احقن 300 µL من الجسيمات المستهدفة للفبرين في الوريد القضيبي للحيوان التجريبي. انقل الحيوان إلى سرير جهاز التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، واستخدم خيطاً متصلاً بدبوس لسحب الأسنان الأمامية العلوية برفق لتقويم الرقبة.

ابدأ عملية التصوير بعد مرور خمس دقائق من حقن جسيمات الذهب النانوية. ولتصوير الخثرة باستخدام التصوير بالأشعة تحت الحمراء القريبة خارج الجسم، ضع أنسجة الدماغ المستأصلة في جهاز التصوير بحيث تكون القاعدة متجهة للأعلى. التقط صوراً للسدادات الخثرية الموصومة فلورياً في شرايين دائرة ويليس.

بعد ذلك، ضع النسيج بحيث تكون القمة متجهة للأعلى وقم بتصوير الخثرات الانصمامية القشرية. قم بترطيب النسيج ببضع قطرات من المحلول الملحي، ثم باستخدام جهاز مصفوفة الدماغ (brain matrix device) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، استخرج بسرعة ست شرائح إكليلية من الدماغ بسمك 2 mm لكل منها. مع الحفاظ على ترطيب الشرائح بالمحلول الملحي، التقط صورًا إضافية بالأشعة تحت الحمراء القريبة لكل من السطحين الأمامي والخلفي للمقاطع.

لتقدير مساحة الخثرة بعد التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، افتح ملفات تسلسل الصور، ثم اختر Image يليها Type ثم 8-bit لتحويل الصور إلى تدرج رمادي بـ 8 بت. عندما يمثل البكسل الواحد في ملفات صور CT مسافة 0.053 مليمتر، استخدم Analyze Set Scale لإدخال 1، و 0.053، و millimeters لكل من Distance in pixels، و Known distance، و Unit of length على التوالي. بعد ذلك، من قائمة Edit، اختر Selection ثم Specify لتحديد منطقة اهتمام في جزء من متن الدماغ يخلو من الخثرات أو المناطق عالية الكثافة المرتبطة بالعظام.

بما أن المنطقة المحددة كمنطقة اهتمام تنطبق على كل شريحة من مجموعة الشرائح، تأكد من أن المنطقة لا تتداخل مع أي منطقة عالية الكثافة في أي من الشرائح. بعد ذلك، من قائمة Plugin، اختر Region of Interest ثم Background Subtraction من قائمة Region of Interest، وأدخل القيمة 2 في خانة Number of standard deviations from the mean. ابحث عن الآفات عالية الكثافة المرتبطة بالانصمام الخثاري وقم بتكبير منطقة الآفة.

الآن، اختر Image ثم Adjust ومن ثم Threshold وأدخل مستوى عتبة سفلى (Lower Threshold Level) بقيمة 22 ومستوى عتبة عليا (Upper Threshold Level) بقيمة 255. حدد خيار Over/Under لعرض البكسلات التي تقل عن قيمة العتبة السفلى باللون الأزرق، والبكسلات الواقعة ضمن نطاق العتبة بالتدرج الرمادي، والبكسلات التي تزيد عن قيمة العتبة العليا باللون الأخضر. بعد ذلك، استخدم أداة التحديد الحر (Freehand selection tool) لرسم مناطق الاهتمام المحيطة بالآفات عالية الكثافة المرتبطة بالانصمام الخثاري دون تضمين أي مناطق عظمية.

استخدم Analyze، Set Measurements لاختيار Area، وMean gray value، وIntegrated density area times mean. حدد الخيارات التالية: Limit to threshold وDisplay label. استخدم Analyze Measure للحصول على البيانات الكمية، ثم احفظ النتائج.

تم الحصول على صور micro-CT المرجعية هذه داخل الجسم الحي بعد خمس دقائق من حقن الجسيمات النانوية الذهبية المستهدفة للفبرين، وذلك بعد ساعة واحدة من حدوث السكتة الدماغية الانصمامية في الفئران. يمكن رؤية الخثرة الدماغية بوضوح في منطقة تفرع الشريان الدماغي الأوسط والشريان الدماغي الأمامي في الجزء القاصي من الشريان السباتي الداخلي. وتظهر صور micro-CT للمتابعة عدم وجود تغييرات في خثرة دائرة ويليس في الحيوانات المعالجة بالمحلول الملحى، بينما تُظهر الحيوانات المعالجة بمنشط البلازمينوجين النسيجي تحللاً تدريجياً لخثرة دائرة ويليس بمرور الوقت، وهو ما تشير إليه رؤوس السهام الزرقاء.

هناك ارتباط قوي بين كثافة التصوير المقطعي المحوسب (CT) في الجسم الحي والتصوير بالأشعة تحت الحمراء القريبة خارج الجسم للجلطات الانصمامية المتبقية بعد مرور 24 ساعة. على سبيل المثال، في هذه الصور، تتوافق المناطق عالية الكثافة في التصوير المقطعي الميكروي (micro-CT)، التي تم تصورها بواسطة جزيئات الذهب المستهدفة للفبرين، بشكل مباشر مع مناطق إشارة الأشعة تحت الحمراء القريبة التي تم تحديدها بواسطة مسبار فلوري حساس لنشاط الربط التشابكي للفبرين بوساطة عامل التخثر 13A، والذي يرتبط بالجلطة أثناء عملية نضج الخثرة المتكونة مسبقاً. علاوة على ذلك، وكما هو موضح في هذه الصور، يمكن استخدام صبغة TTC لتقييم آثار تحلل الخثرة في تلف الدماغ الإقفاري في الحيوانات التي تلقت محلولاً ملحياً (مجموعة الضبط) مقارنة بالحيوانات التي عولجت بنشط البلازمينوجين النسيجي.

بمجرد إتقان هذه التقنية الخاصة بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) داخل الجسم والتصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة للخثرة خارج الجسم، يمكن إتمام العملية في غضون ساعة واحدة تقريباً إذا نُفذت بشكل صحيح وعند توفر مجسات التصوير. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام جسيمات الذهب النانوية غير المتكتلة والموجهة نحو الفبرين للتصوير المباشر للخثرة الدماغية القائم على micro-CT. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني أو ICPMS، وهو مطياف الكتلة بـالبلازما المقترنة حثياً، للإجابة على أسئلة إضافية مثل التوزيع النسيجي وحركية الدم لجسيمات الذهب النانوية.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال السكتة الدماغية أو أبحاث القلب والأوعية الدموية لاستكشاف الانصمام الخثاري في نماذج حيوانية كانت عرضة للتخثر التاجي أو الاحتشاء الدماغي الانصمامي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خثرات موسومة بفلوريسنت للسكتة الدماغية الانصمامية الخثارية في الفئران، وإجراء التصوير التسلسلي والتقدير الكمي للانصمامات الخثارية الدماغية داخل الجسم (in vivo) ثم خارج الجسم (ex vivo)، وبالتالي مراقبة تطور الخثرة.