توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

الهدف العام من هذه الدراسة هو مقارنة طريقتين مختلفتين لعزل الخلايا الأحادية البشرية لتوليد الخلايا المتغصنة في المختبر وتوصيف التعبير السطحي للخلية CT11c و CT14 للمجموعات السكانية المشتقة من الخلايا الوحيدة الناتجة عن طريق تصوير قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تساهم بروتوكولات عزل الخلايا الوحيدة هذه في تطوير طرق موثوقة لتنقية الخلايا المتغصنة البشرية للبحث والتطبيقات السريرية. الميزة الرئيسية لهذه البروتوكولات هي أنها تسهل عزل الخلايا الوحيدة البشرية وتمايزها إلى خلايا مشتقة من الخلايا الوحيدة قابلة للحياة والوظيفية.

بالإضافة إلى ذلك ، هذه هي الدراسة الأولى التي تميز مجموعة محددة من الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة عن طريق قياس تدفق الخلايا بتصوير خلية واحدة. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة كبديل لعزل الخلايا النادرة الأخرى بعائد كاف لتطبيقات البحث النهائي. يعد العرض المرئي لهذه الطرق أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب التعامل مع عينات الدم بأمان دون التعليمات والخبرة المناسبة.

ابدأ بتخفيف عينة الدم إلى نسبة واحد إلى واحد باستخدام PBS في قارورة T75. ثم أضف 15 مل من محلول تدرج الكثافة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وقم بطبقة 25 إلى 30 مل من الدم المخفف بعناية فوق التدرج. لتحقيق الفصل المناسب لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، قم بتحميل الدم على محلول تدرج الكثافة بسرعة ، ولكن بعناية ودون خلط الطبقات.

افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بنقل طبقة واجهة خلايا الدم البيضاء إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. اغسل الخلايا مرتين في PBS ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 10 ملليلتر من محلول البوتاسيوم لكلوريد الأمونيوم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا مرتين أخريين في PBS.

لعزل الخلايا الوحيدة بطريقة الالتصاق ، قم بزراعة خمس مرات 10 إلى الخلايا السبع لحبيبات PBMC الناتجة لكل 10 ملليلتر من الوسط الكامل في قارورة T75 جديدة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. في نهاية الحضانة ، تخلص من الخلايا العائمة غير الملتصقة واغسل الخلايا الملتصقة برفق مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بتغذية الخلايا الملتصقة بوسط زراعة خلية كامل مكمل ب GMCSF البشري و IL4 وأعد المزرعة إلى الحاضنة لمدة خمسة إلى سبعة أيام.

لعزل الخلايا الوحيدة عن طريق الفصل المغناطيسي ، بعد جمع PBMC عن طريق فصل التدرج الكثافة ، قم بنقل طبقة خلايا الدم البيضاء إلى أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر وإعادة تعليق الخلايا في PBS بتركيز خمسة أضعاف 10 إلى سبع خلايا لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل تخصيب الخلايا الأحادية البشرية لكل مليلتر إلى الخلايا مع الخلط واحتضان الخلايا بالكوكتيل عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أضف 50 ميكرولترا من الجسيمات المغناطيسية لكل مليلتر من الخلايا مع الخلط الدقيق واحتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

في نهاية الحضانة الثانية ، أضف PBS إلى الخلايا ليصل الحجم الإجمالي إلى نقطتين وخمسة ملليلتر واخلطها عن طريق سحب العينات مرتين إلى ثلاث مرات. ثم ضع أنبوب البوليسترين في جهاز مغناطيسي مناسب في درجة حرارة الغرفة. بعد دقيقتين ونصف ، مع بقاء الأنبوب في المغناطيس ، صب جزء الخلية الأحادية المنقى في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

ثم استزراع الخلايا الوحيدة المنقاة ووسط زراعة الخلايا الكامل المكمل ب GMCSF و IL4 لمدة خمسة إلى سبعة أيام كما هو موضح للتو. بعد سبعة أيام من التمايز ، قم بتوزيع 10 في 10 إلى أليكوات الخلايا الست للخلايا المتغصنة المشتقة من الخلية الوحيدة في العدد المناسب من أنابيب واحدة من خمسة مليلتر ، وأضف 50 ميكرولترا من المصل البشري المعطل بالحرارة إلى كل عينة لمنع أي نتيجة غير محددة. بعد 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للخلايا وأعد تعليق الكريات في الأجسام المضادة الأولية المترافقة الفلورية المناسبة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء.

ثم اغسل الخلايا مرتين في مليلتر واحد من PBS ، وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من PBS لكل واحد في عشرة إلى الخلايا الست. قبل التحليل مباشرة ، أضف ميكرولتر واحد من DAPI إلى كل أنبوب. بعد ذلك ، اقرأ العينات على مقياس تدفق التصوير الخلوي أحادي الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

في المتوسط ، تمثل الخلايا الوحيدة المعزولة بطريقة الالتصاق ما يقرب من ستة نقاط واثنين بالمائة من إجمالي خلايا وحيدة الدم المحيطية ، أو PBMC ، بينما تمثل الخلايا الوحيدة المعزولة عن طريق الفصل المغناطيسي ما يصل إلى 25 في المائة من إجمالي PBMC. الخلايا الوحيدة المعزولة بأي من الطريقتين قابلة للحياة بنفس القدر. تم تبييت MDDCs المتمايزة عن الخلايا الوحيدة المنقاة بكلتا الطريقتين أولا بناء على خلايا DAPI السالبة أو القابلة للحياة من إجمالي الخلايا المفردة ، تليها بوابة كل مجموعة من الخلايا.

أسفرت كلتا طريقتي العزل عن عدد قليل من السكان الإيجابيين CD14 وأسفرت كلتا الطريقتين عن إجمالي عدد كبير من السكان الإيجابيين CD11c. تم إجراء مزيد من التحليل الظاهري على جميع الخلايا الإيجابية CD11c ، وعلى الرغم من أن العزل المغناطيسي يعطي نسبة أعلى من الخلايا الإيجابية المزدوجة CD11c الإيجابية CD14 ، إلا أن هذا التأثير لم يكن مهما عند مقارنته بطريقة الالتصاق. قد تكون هذه الخلايا الإيجابية المزدوجة CD11c الإيجابية و CD14 عبارة عن MDDCs متمايزة في مرحلة مبكرة لم تسقط بعد علامة CD14 أحادية الخلية.

عند تحليل الخلايا الموجبة المفردة CD11c ، تعطي طريقة الالتزام أعلى عائد من الخلايا الإيجابية CD11c ، CD14 السلبية. قد تكون هذه الخلايا الموجبة المفردة MDDCs متمايزة في المرحلة المتأخرة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنيات الالتزام والعزل المغناطيسي في غضون ثلاث إلى أربع ساعات ومن ساعة إلى ساعتين على التوالي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن يكون لديك سيتوكينات جديدة لتمايز الخلايا المتغصنة كل 48 ساعة عند تجديد الوسط. يمكن أن يكون العمل مع السوائل الخطرة البيولوجية مثل الدم ضارا للغاية ، ويجب دائما استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وطرق التخلص عند تنفيذ هذه الإجراءات. تمهد هذه الدراسة الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف استخدام الخلايا الوحيدة البشرية والخلايا المتغصنة للعلاج العلاجي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحسين عزل الخلايا الأحادية البشرية لتوليد مجموعات مختلفة من الخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة في المختبر.