والمحتوى العالي في المختبر البنكرياس جزيرة β خلايا النسخ المتماثل منصة ديسكفري

تحديات بالغة الأهمية للبحث ميداني مرض السكري لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم جزيرة تكرار β خلايا وتطوير طرق لتحفيز تجديد خلايا بيتا. هنا طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد وتقييم وقدم النشاط ودعم تكرار β-خلية من جزيئات صغيرة.

الهدف العام من منصة فحص تكاثر خلايا بيتا عالية المحتوى ، هو تسهيل التحقيق في المسارات الجزيئية التي تقيد نمو خلايا بيتا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة مهمة في مجال بيولوجيا الخلية التجريبية. مثل أحد جزيئات الإشارات الرئيسية والمسارات التي تتحكم في تجديد خلايا بيتا.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح زيادة بطانة خلية الإنتاجية إلى تقييم محدد ومحلل البيانات الآلي لتكرار خلية الجزيرة الأولية. إن استخدام هذه التقنية لديه القدرة على التوسع نحو تطوير العلاج التجديدي لمرض السكري. مرض له تكلفة صحية واقتصادية كبيرة لمجتمعنا.

ابدأ باستخدام محلول هضمي للبنكرياس محمل بحقنة سعة 10 مليلتر ومزودة بإبرة قياس 22 لمحاكاة القناة الصفراوية المشتركة عند تقاطع القنوات الكيسية والقنوات الكبدية الشائعة أو بعيدة عنها. دعم القناة الصفراوية المشتركة بمقبض مشرط ، حقن ببطء 10 مل من المحلول. بعد إعطاء كل الكولاجيناز ، استخدم ملقطا ومقصا منحنيا لفصل البنكرياس المنتفخ عن القولون الهابط والأمعاء والمعدة والشريحة.

ثم ضع ما يصل إلى اثنين من البنكرياس في أنبوب سعة 50 مل على ثلج يحتوي على خمسة ملليلتر من محلول هضم البنكرياس. عندما يتم جمع البنكرياس بالكامل ، ضع أنابيب الهضم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع تحريك لطيف كل ثلاث دقائق. في نهاية عملية الهضم ، هز الأنابيب بقوة عموديا 10 مرات.

وأضف 10 مل من مخازن الغسيل البارد إلى العينات. رج الأنابيب بقوة خمس مرات أخرى وضعها على الجليد. بعد ذلك ، املأ الأنابيب إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل بمحلول الغسيل البارد واقلب الأنابيب خمس مرات.

ثم قم بتدوير الأنسجة وسكب المواد الطاففة ، مع الحرص على عدم إزاحة الكريات. أعد تعليق ملاط الأنسجة في 25 مل من محلول الغسيل متبوعا بدوامة لطيفة. كرر خطوات الدوران وإعادة التعليق مرتين أخريين.

صب معلقات الأنسجة من خلال منخل نسيج شبكي 30 في دورق معقم سعة 250 مل. اشطف أنابيب الهضم بكمية إضافية من محلول الغسيل واسكب الغسالات على الشبكة لإزالة أنسجة البنكرياس والدهنية غير المهضومة. قسم المادة المفلترة بين أنبوبين جديدين سعة 50 مليلتر وحبيبات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي.

ثم صب المادة الطافية وقلب الأنابيب لتصريف المخزن المؤقت الزائد. لتنقية الجزر ، أضف 20 مل من تدرج الكثافة الباردة إلى كريات أنسجة البنكرياس وقم بسحب الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل خمس مرات لإعادة تعليق المحتويات بشكل متجانس. بعد ذلك ، قم بتراكب 10 ملليلتر من HBSS ببطء أسفل جدار كل أنبوب من التدرج مع الحرص على الحفاظ على واجهة سائلة حادة وفصل خلايا البنكرياس عن طريق الطرد المركزي.

استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل طبقة الجزيرة من الواجهة إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 ملليلترا. ثم اغسل الجزر في 40 إلى 50 مل من مخزن الغسيل ثلاث مرات. عكس أنابيبها لإعادة تعليق الكريات بين كل طرد مركزي.

بعد الغسيل النهائي ، أحضر الأنابيب إلى غطاء مزرعة الأنسجة. شفط المادة الطافية. وأعد تعليق الكريات في ستة ملليلتر من وسط الجزيرة.

غربلة الجزر من كل أنبوب في آبار فردية من ستة ألواح زراعة أنسجة جيدة. وقم بتدوير اللوحة لجمع الجزر الصغيرة في وسط الآبار. تقييم نقاء الجزيرة تحت المجهر.

لمزيد من تنقية الجزر ، اجمعها باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد وانقلها إلى البئر المجاور باستخدام ستة ملليلتر من وسط الجزيرة. كرر دوران الجزيرة والجمع والنقل والتقييم المجهري حتى يتم تحقيق نقاء أكبر من 90 بالمائة. بعد ذلك ، انقل الجزر إلى طبق واحد لزراعة الأنسجة بطول 10 سم يحتوي على 20 مل من وسط الجزيرة.

بعد حصاد جميع الجزر ، ضع طبق الثقافة في حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. ثم قم بتغطية آبار صفيحة 384 بئر ب 40 ميكرولتر من 804 جرام ، وسط مكيف لكل بئر وضع الطبق في الحاضنة طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم مكشطة الخلية لفصل الجزر برفق.

ثم انقل الجزر إلى أنبوب سعة 50 مل. اجمع الجزر عن طريق الطرد المركزي. ثم اغسلها ب 20 مل من p ، b ، s الدافئة.

جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة. شفط المادة الطافية. وأعد تعليق الحبيبات في صفر نقطة اثنين ، خمسة بالمائة من التربسين.

احتضان الجزر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد لشفط الجزر وتوزيعها 10 مرات في خمس و 10 دقائق. بعد الثلاثية الثانية ، عد عينة سعة 20 ميكرولتر من خلايا الجزيرة المثقببة. إذا تم هضم الأنسجة بالكامل ، فقم بتعليق خلايا الجزر الانفصالية عند أربع نقاط خمسة في عشرة إلى أربع خلايا لكل تركيز مليلتر في وسط وظيفة الجزيرة.

ثم استخدم شفاطة مشعب 12 بئر لإزالة وسط الحالة 804G من لوحة البئر 384 المعدة مسبقا. وغربل 70 ميكرولترا من الجزر لكل بئر في صفوف من c إلى n في الأعمدة من أربعة إلى 21. اسمح للجزر بالالتصاق بحاضنة زراعة الأنسجة لمدة 48 ساعة.

بعد يومين ، استخدم الشفاط المشعب 12 جيدا لإزالة وسط الجزيرة بعناية واستخدم ماصة 12 قناة لإضافة 35 ميكرولترا من وسط وظيفة الجزيرة إلى كل بئر. ثم انقل 35 ميكرولترا من المحاليل المركبة المعدة حديثا إلى كل بئر. وأعد الجزر إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة أخرى.

بعد 48 ساعة ، قم بإصلاح ثقافات الجزر الصغيرة المعالجة بالمركبة وتلطيخها وتحليلها باستخدام منصة تصوير آلية عالية المحتوى. في تجربة نموذجية ، يتم تحديد معدل النسخ المتماثل لخلايا بيتا DAPI و PD-1 والأنسولين الإيجابية من خلال النسبة المئوية لخلايا بيتا التي تعبر عن Ki-67. يتم قياس تكاثر خلايا ألفا كنسبة مئوية من الخلايا الموجبة DAPI الإيجابية ، والسلبية PD ، وإيجابية الجلوكاجون ، والخلايا التي تعبر عنها Ki-67.

على سبيل المثال في هذه التجربة التمثيلية ، لوحظ أن Dipryridamole يعزز تكرار خلايا بيتا ولكن ليس خلايا ألفا. يمكن إكمال هذه التقنية في سبعة أيام. بعد هذا الإجراء ، يمكن دراسة المركبات التي يمكن دراستها في تكاثر خلايا بيتا بشكل أكبر للكشف عن آليات العمل.

مكنت هذه التقنية الأبحاث في مجال بيولوجيا خلايا بيتا من تحديد عوامل ومسارات الإشارات الجديدة التي تنظم نمو خلايا بيتا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار قدرة الجزيئات الصغيرة على تحفيز تجديد خلايا بيتا بشكل انتقائي.