التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الخلايا المسماة بالبروتين الفلوري حجميا في أعماق القلوب السليمة ، لدراسة وظيفة الجينات بدقة خلية واحدة أثناء نمو القلب وفي قلوب ما بعد الولادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية أثناء نمو القلب ، مثل دراسة وظائف الجينات ومساعدة الصورة بدقة خلية واحدة أثناء نمو القلب والتحف المتحركة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها بسيطة نسبيا وغير مكلفة ومؤيدة للحكمة في هذا التحليل الزمني الخاص لوظائف الجينات والبروتين بدقة خلية واحدة في الجنين أو القلب السليم.

على الرغم من أننا نستخدم هذا النظام لدراسة نمو القلب في الفئران ، إلا أنه يمكنك استخدامه أيضا لدراسة أجهزة الأعضاء الأخرى ، مثل العضلات والدماغ والرئتين وفي الكائنات الحية النموذجية الأخرى أيضا. يتم استخدام الأجنة الإيجابية للبروتين الفلوري من سدود قصاصات الورق R-26 Cre-RET2 المعالجة بتاموكسيفرين هنا. ابدأ في التلوين عن طريق غمر كل جنين مثبت ببارافورمالدهيد في مليلتر واحد من 0.1٪ PBST في آبار صفيحة 48 بئر.

احتضن لمدة ساعتين على شاكر طبق في درجة حرارة الغرفة لاختراق الأنسجة. بعد ذلك ، استبدل محلول النفاذية بمل واحد من المخزن المؤقت المانع واحتضانه ، مع الرج ، لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف واحد إلى 100 من الجسم المضاد الخاص بالخلايا البطانية ، PECAM ، في 0.3 مل من المخزن المؤقت المانع لكل بئر وأضفه إلى الآبار التي تحتوي على الأجنة.

احتضن لمدة 48 ساعة مع الرج عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الأجنة خمس مرات باستخدام PBST لمدة 30 دقيقة في كل مرة لإزالة الجسم المضاد الأولي الزائد من الأنسجة. بعد ذلك ، اغمر الأجنة في محلول الأجسام المضادة الثانوية للماعز Alexa Fluor 647 واحتضانها مع الاهتزاز لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية ، بينما تكون محمية من الضوء.

بعد 48 ساعة ، بعد الغسيل من قبل ، قم بإصلاح الأجنة بنسبة 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج. ثم ، بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة ، احتضان الأجنة بصبغة DAPI النووية لمدة عشر دقائق. اتبع غسلتين من PBS مدة كل منهما خمس دقائق ، ثم انتقل إلى تنظيف الأنسجة.

تنظيف الأنسجة الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول من أجل تصوير القلب بدقة خلية واحدة. أيضا ، يعد اختيار طريقة المقاصة إما على نطاق أو مكعب ، أمرا مهما جدا من أجل الحفاظ على إشارات الفلورسنت في القلب الجنيني السليم. انقل الأجنة المغسولة والملطخة إلى قارورة تلألؤ ملفوفة بورق الألمنيوم ، والتي تحتوي على مليلتر واحد من محلول A2 على نطاق واسع.

احتضن عند أربع درجات مئوية مع هز لطيف من حين لآخر باليد لمدة 48 ساعة. بعد حضانة المقياس A2 ، استبدل المحلول الموجود في القارورة بمليلتر واحد من محلول مقياس B4 ، واحتضنه عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف من حين لآخر لمدة 48 ساعة أخرى. احتضان الأجنة لمدة 48 ساعة أخرى باستخدام مليلتر واحد من مقياس 70 عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف من حين لآخر كما كان من قبل.

أخيرا ، اغمر العينة التي تم تطهيرها في مليلتر واحد من 90٪ من الجلسرين وخزنها عند أربع درجات مئوية حتى التصوير. للتصوير ، انقل العينة إلى طبق بتري ذو قاع زجاجي بكمية لا تقل عن 90٪ من الجلسرين والصورة باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بقدرتين فوتونيين. للتصفية المكعبة ، اغمر كل جنين في مليلتر واحد من مكعب واحد مع رج لطيف من حين لآخر لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد 48 ساعة ، استبدل المحلول بنفس الحجم من كاشف CUBIC الطازج واحتضان العينة لمدة 48 ساعة إضافية ، كما كان من قبل. بعد الحضانة, غسل ال [ككب] واحدة يعالج أجنة مع [ببس] عدة مرات مع لطيفة يهز باليد أن يزيل ال [كب] واحدة محلولة زائدة. بعد ذلك ، اغمر الأجنة في محلول CUBIC two لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع هز لطيف من حين لآخر باليد.

إذا كان هناك تأخير قبل التصوير ، فقم باحتضان العينات بالتتابع بمليلتر واحد من 30٪ 50٪ و 70٪ جلسرين و PBS لمدة 30 دقيقة لكل منهما. بعد الانتقال عبر السلسلة ، انقله إلى محلول الجلسرين بنسبة 90٪ للتخزين عند أربع درجات مئوية. عندما تصبح جاهزا ، قم بالصور في طبق بتري ذو قاع زجاجي يحتوي على 90٪ من الجلسرين ، كما كان من قبل.

يعرض هذا الفيلم أقساما بصرية لقلب E 8.75 المعالج بالمقياس ، من سطح القلب إلى التجويف. يشير اللون الأصفر إلى تعبير PECAM وتظهر جميع خلايا عضلة القلب باللون الأخضر. العمق 110.4 ميكرون وهناك 93 شريحة في المجموع.

هذه هي الصورة السطحية ثلاثية الأبعاد للقلب المعاد بناؤه الموضحة للتو. مرة أخرى ، يشير اللون الأصفر إلى تعبير PECAM ، واللون الأخضر يضع علامة على جميع خلايا عضلة القلب. يعرض هذا الفيلم أقساما من استنساخ سلف واحد من قلب E 9.5 المعالج على نطاق واسع في منطقة التدفق الخارجي.

يشير اللون الأصفر إلى تعبير PECAM ويظهر الاستنساخ باللون الأخضر. العمق 36 ميكرون وهناك 10 شرائح في المجموع. يعرض هذا الفيلم أقساما من قلب P المعالج بمكعب من السطح إلى التجويف.

العمق 130 ميكرون مع ثلاثة ميكرون لكل قسم. يعرض هذا الفيلم أقساما من قلب E 17.5 المعالج بمكعب من السطح إلى التجويف. العمق 630 ميكرون مع ستة ميكرون لكل قسم.

هذه صورة سطحية ثلاثية الأبعاد للقلب معروضة للتو ، أعيد بناؤها عبر برنامج إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الجنين هش ويمكن أن ينزعج أمراض القلب بسهولة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحقيق بروتين آخر ، باستخدام التلوين لدراسة وظيفة الجينات في مرحلة ما بعد الولادة والرغوة.