قياس في المختبر أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد نشاط ATPase في المختبر للبروتينات المنقاة للتوصيف الوظيفي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوصيف ATPases المفترضة الجديدة ، وتقييم المنشطات أو المثبطات المحتملة الفعالة وتحديد مساهمة مجالات أو بقايا معينة في نشاط ATPase. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة بسيطة وحساسة لقياس نشاط ATPase في المختبر ويمكن تحسينها بسهولة.

قم بإعداد مخزون من جميع الكواشف اللازمة للحضانة بالبروتين المنقى كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بالخلط المسبق 100 مللي مولار من كلوريد المغنيسيوم و 100 مللي مولار ATP بنسبة واحد إلى واحد قبل إعداد تفاعل التحلل المائي ATP مباشرة. قم بإعداد وتسمية أنابيب سعة 1.5 ملليلتر لجمع العينات على فترات منتظمة طوال فترة التفاعل.

قم بإعداد الأنابيب لجمع العينات في أوقات الصفر وكذلك في أوقات 15 و 30 و 45 و 60 دقيقة. أضف 245 ميكرولترا من 1x HNG المؤقت إلى كل أنبوب لتخفيف العينات التي تم جمعها من تفاعلات التحلل المائي ATP عند تخفيف واحد إلى 50. بعد ذلك ، قم بإعداد حمام من الثلج الجاف والإيثانول لتجميد العينات بسرعة لوقف التفاعل.

في دلو ثلج مطاطي أو حاوية آمنة أخرى ، أضف عدة قطع من الثلج الجاف واسكب بعناية ما يكفي من 70٪ إلى 100٪ من الإيثانول لتغطية الثلج الجاف. قم بتخفيف البروتين المنقى في 1X HNG المخزن المؤقت واحتفظ به على الجليد. قم بإعداد تفاعلات التحلل المائي ATP في أنابيب 0.5 ملليلتر المحضرة عن طريق إضافة حجم محسوب مسبقا من الماء للوصول إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 30 ميكرولترا.

متبوعا بستة ميكرولترات من 5X HNG أو أي مخزن مؤقت آخر ، وثلاثة ميكرولتر من خليط ATP من كلوريد المغنيسيوم 100 مللي مولار و 0.25 إلى خمسة بروتين ميكرومولار. احتضان حالة تحكم سلبية فقط في المخزن المؤقت لا يتم فيها إضافة أي بروتين. بعد ذلك ، قم بإزالة خمسة ميكرولترات من التفاعل في بعض الأحيان صفر.

ثم قم بتخفيف الكمية من واحد إلى 50 في أنبوب 1.5 مليلتر المحضر الذي يحتوي على 245 ميكرولتر من المخزن المؤقت HNG. قم بتجميد العينة على الفور في حمام الإيثانول الثلجي الجاف. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية للسماح بحدوث التحلل المائي ل ATP لمدة ساعة واحدة.

في كل فاصل زمني ، قم بإزالة خمسة أجزاء ميكرولتر من التفاعل وأضفها إلى أنابيب العينة المصنفة التي تحتوي على عازلة HNG كما كان من قبل. في نهاية تفاعل التحلل المائي ATP ، انقل العينات المخففة إلى فريزر 80 درجة مئوية للتخزين. للتأكد من تجميد جميع العينات تماما ، انتظر 10 دقائق على الأقل قبل المتابعة.

قم بإذابة العينات المخففة التي تحتوي على حصصات تفاعل التحلل المائي ATP من كل نقطة زمنية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد صفيحة 96 بئر تحتوي على عينات ومعايير الفوسفات. في أنبوب 0.5 مليلتر ، قم بتخفيف معيار الفوسفات من 800 ميكرومولار إلى 40 ميكرومولار عن طريق إضافة 5.5 ميكرولتر من المعيار إلى 104.5 ميكرولتر من مخزن HNG.

تخلط جيدا وتضاف 100 ميكرولتر من معيار الفوسفات 40 ميكرومولار إلى البئر A1 من لوحة 96 البئر. أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت HNG إلى الآبار B1 إلى H1 لتخفيفات تسلسلية واحدة إلى واحدة لمعيار الفوسفات. قم بإزالة 50 ميكرولترا من 40 ميكرومولار فوسفات من البئر A1 ، وأضفه إلى 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص في البئر B1 واخلطه.

ثم قم بإزالة 50 ميكرولتر من البئر B1 وأضفها إلى البئر C1 ، مع استمرار التخفيفات من خلال البئر G1. تخلص من 50 ميكرولتر من البئر G1 بعد الخلط للتأكد من أن كل بئر له نفس الحجم. يجب أن يحتوي البئر H1 على مخزن مؤقت فقط لإنشاء معيار فوسفات من 40 إلى صفر ميكرومولار. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كل عينة في نسختين إلى اللوحة.

أضف عينات من نفس النقطة الزمنية في أعمدة عموديا ومن نقاط زمنية مختلفة أفقيا. هذا يسمح بما يصل إلى ثماني عينات وخمس نقاط زمنية لكل لوحة. استخدم ماصة معقمة لإزالة ما يكفي من كاشف الكشف عن فوسفات المليبتات الأخضر من الملكيت لإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر يحتوي على عينات ومعايير.

أضف كاشف الكشف إلى طبق لسهولة سحب العينات باستخدام ماصة متعددة القنوات. لا تصب كاشف الكشف مباشرة في الطبق حيث من المحتمل حدوث تلوث بالفوسفات. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن الفوسفات إلى كل بئر واخلطه بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لعدد ثابت من المرات دون إدخال فقاعات، والعمل بالترتيب من النقطة الزمنية الأخيرة إلى النقطة الزمنية الأولى.

اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة أو وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. لتقدير النتائج ، اقرأ امتصاص العينات عند 650 نانومتر باستخدام قارئ لوحة صغيرة امتصاص. يتم عرض النتائج التمثيلية ل ATPases الحركية ونقطة النهاية ، حيث يتم تحديد نشاط النوع البري والأشكال الطافرة من النوع الثاني من إفراز ATPase / EPSE في وجود وعدم وجود كارديوليبين منشط.

تظهر هنا نتائج ATPase الحركي المحفز بالقلب ، مما يدل على إطلاق الفوسفات الخطي بمرور الوقت ل EPSE من النوع البري وطفرة الليسين المزدوجة ، مع ألبومين مصل الأبقار كعنصر تحكم سلبي. يمكن تمثيل هذه البيانات على أنها كمية الفوسفات المنبعثة في الدقيقة مقسومة على تركيز البروتين من أجل تحديد ومقارنة نشاط ATPase لكل بروتين. تشير البيانات إلى أن اثنين من بقايا اللايسين ، K417 و K419 ، يسهمان في نشاط ATPase المحفز بالقلب في EPSE.

من المقارنة بين نشاط ATPase لنفس البروتينات دون تحفيز القلب يظهر أن هذين بقايا اللايسين لا يسهمان في النشاط القاعدي المنخفض ل EPSE ، بل في قدرة البروتين على التحفيز بواسطة كارديوليبين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نشاط ATPase للبروتينات المنقاة بسرعة ودقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراعاة حساسية كاشف الكشف عن الفوسفات.

لتجنب تلوث الفوسفات ، نوصي باستخدام الأواني البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والمياه فائقة النقاء وإجراء استبعاد الحجم أو كروماتوغرافيا التبادل الأيوني بعد تنقية البروتين.