Name: قياس في المختبر أتباز آخر لالأنزيمية توصيف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: تعلم قياس نشاط الأتباز في المختبر للبروتينات النقية لتوصيفها الوظيفي. تُستخدم هذه الطريقة لتقييم المنشطات أو المثبطات المحتملة ودراسة مساهمة النطاقات في النشاط الأنزيمي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة RO1AI049294 (إلى MS.).

1. تنفيذ ATP الحلمأة رد الفعل مع البروتين النقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخزونات جميع الكواشف اللازمة لحضانة مع البروتين النقي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة 5X HEPES / كلوريد الصوديوم / الجلسرين (هنج) تحتوي على 100 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8.5، 65 مم كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين (أو عازلة فحص آخر حسب الاقتضاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ملي MgCl 2 (أو المعادن الأخرى، إذا أتباز يعتمد المعادن) في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطازجة 100 ملي اعبي التنس المحترفين في 200 ملي قاعدة تريس (لا ضبط درجة الحموضة مزيد) باستخدام عالية ATP النقاء. قسامة وتخزين الأوراق المالية اعبي التنس المحترفين في -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن بضعة أسابيع، كما ATP سوف تنهار مع مرور الوقت، والامتناع عن تجميد وذوبان الأسهم اعبي التنس المحترفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بريمكس MgCl 2 و ATP في نسبة 1: 1 قبل وضع رد فعل التحلل اعبي التنس المحترفين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير تسمية 1.5 مل أنابيب لجمع العينات على فترات منتظمة طوال رد فعل. إعداد أنابيب جمع العينات في وقت 0 وفي وقت 15، 30،45، و 60 دقيقة. ملاحظة: وكبديل، وجمع عينات فقط في وقت 0 ونقطة النهاية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 245 ميكرولتر العازلة 1X هنغ إلى كل أنبوب من أجل تمييع العينات التي تم جمعها من ردود الفعل المائي ATP 01:50. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حمام من الثلج الجاف والايثانول لتجميد بسرعة عينات لوقف التفاعل. في دلو المطاط الجليد أو آمنة الأخرى (غير البلاستيك) حاوية، إضافة عدة قطع من الثلج الجاف وتصب بعناية ما يكفي من 70-100٪ من الإيثانول لتغطية الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع البروتين النقي في المخزن هنغ 1X، حسب الاقتضاء (عادة 5-10 ميكرون)، والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود فعل التحلل اعبي التنس المحترفين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في منفصلة 0.5 مل أنابيب لكل عينة، إضافة الكواشف التالية (بالترتيب): H 2 O (تصل إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر)، 6 ميكرولتر 5X هنغ أو عازلة آخرين، 3 ميكرولتر 100 ملي MgCl 2 -ATP الخليط، و،25-5 البروتين ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشمل منطقة عازلة فقط حالة السيطرة السلبية التي لم تتم إضافة البروتين.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 5 ميكرولتر من رد فعل في وقت 0، وتمييع 01:50 في أنبوب 1.5 مل استعداد تحتوي على 245 عازلة هنغ ميكرولتر، وتجميد فورا العينة في حمام الثلج / الايثانول الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية للسماح للاعبي التنس المحترفين المائي للتحدث لمدة 1 ساعة. في كل فترة (15، 30، 45، و 60 دقيقة)، وإزالة 5 مكل من التفاعل وإضافة إلى أنابيب العينات وصفت تحتوي عازلة هنغ كما في الخطوة 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية التفاعل المائي ATP، نقل عينات المخفف إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين. لضمان تجميد جميع العينات تماما، انتظر على الأقل 10 دقيقة قبل المتابعة. </li></ol> 2. عينات احتضان يتضمن بي الحرة مع كشف الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات ذوبان الجليد المخففة التي تحتوي على ATP قسامات رد فعل التحلل في كل نقطة زمنية (تم الحصول عليها من الخطوات 1.6 و 1.7) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة 96-جيدا تحتوي على عينات والمعايير الفوسفات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مل تو 0.5يكون، يخفف من مستوى الفوسفات (المتوفرة مع بي كشف كاشف) من 800 ميكرومتر إلى 40 ميكرومتر بإضافة 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت هنغ 800 ميكرومتر القياسية إلى 104.5 ميكرولتر. تخلط جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر من هذا 40 ميكرومتر بي المعيار إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العازلة هنغ 50 ميكرولتر من الآبار B1-H1 لل1: 1 التخفيفات التسلسلي للمعيار بي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 50 ميكرولتر من 40 ميكرومتر بي من A1 جيدا وإضافة إلى عازلة فحص 50 ميكرولتر في B1 جيدا، خلط، وإزالة 50 ميكرولتر من B1 جيدا وإضافة إلى ما C1، التخفيفات المستمر من خلال G1 جيدا. تجاهل 50 ميكرولتر من G1 جيدا بعد خلطه لضمان كل بئر لديه نفس الحجم. كذلك يجب أن تحتوي H1 عازلة الوحيد لخلق معيار بي 40-0 ميكرومتر. ملاحظة: إذا تمت إضافة عامل إضافي (مثل مثبطات) للعينات، وخلق منحنى القياسية التي تحتوي على هذا العامل للسيطرة على التغيرات في الافراج عن الفوسفات أو الامتصاصية في ظل هذه الظروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من كل عصيدةلو في نسختين لوحة. إضافة عينات من نقطة زمنية واحدة في الأعمدة عموديا (عينة 1 مرة 0 = A2، A3، عينة 2 مرة 0 = B2، B3) ونقاط زمنية مختلفة أفقيا. هذا يسمح لمدة تصل إلى 8 عينات و 5 نقاط الوقت لكل لوحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة العقيمة لإزالة ما يكفي من المرمر الأخضر / موليبدات بي كشف كاشف لإضافة 100 ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على عينات والمعايير (كاشف اللازمة (مل) = 0.1 × عدد العينات والمعايير) وإضافة إلى طبق لسهولة pipetting ل باستخدام الماصة متعدد القنوات. لا صب كاشف الكشف مباشرة في طبق، حيث من المحتمل أن يحدث تلوث بي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من كشف كاشف بي إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting بعناية صعودا وهبوطا عدد ثابت من الأوقات دون فقاعات إدخال، ويفضل أن يكون في أمر من النقاط الزمنية الماضية إلى نقطة لأول مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو وفقا لأماهالاتجاهات nufacturer و. </li></ol> 3. النتائج Quantitate باستخدام قارئ صفيحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الامتصاصية من العينات في 650 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل منحنى القياسية بي. باستخدام برنامج الرسوم البيانية، رسم بياني لقيم الامتصاصية للعينات بي القياسية مقابل تركيز من أجل إيجاد المعادلة المستخدمة في حل لكمية الفوسفات في كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النشاط أتباز لكل عينة من معايرة مع معيار الفوسفات. الفوسفات صدر = (OD 650 - Y التقاطع) / المنحدر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​مجموع بي من التكرارات من كل عينة. طرح القراءة الامتصاصية سيطرة عازلة الوحيد من هذا الرقم. اضرب هذا من قبل عامل التخفيف (50 في مثالنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بي نانومول صدر في البروتين مكرومول. يجب أن الرسوم البيانية هذه القيم لكل نقطة زمنية في مقايسة الحركية تسفر عن نوبات الخطية على الأقل R = 0.99 (الشكل 1). إذا كان nبعد التمديد، ويمكن تعديل مقايسة مع أكثر أو أقل من البروتين أو فترة حضانة أطول أو أقصر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمثل النتائج على النحو نانومول بي / مكرومول بروتين / دقيقة (الشكلان 2 و 3)، أو البروتين نانومول بي / ميكروغرام / دقيقة إذا رغبت في ذلك. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هذا هو بروتوكول عام لقياس النشاط أتباز المختبر من البروتينات النقاء لتوصيف والكيمياء الحيوية. هذه الطريقة بسهولة الأمثل. على سبيل المثال، وضبط كمية من البروتين، العازلة والتراكيب الملح، ودرجة الحرارة، وتتراوح مدة الفحص وفترات (بما في ذلك زيادة عدد فترات) يمكن أن تحسن الكميات النشاط. متوفرة تجاريا الكواشف مقرها الخضراء المرمر حساسة للغاية، ويمكن الكشف عن كميات صغيرة من الفوسفات خالية (50 ~ بمول في 100 ميكرولتر). بسبب حساسية هذا الاختبار، فإنه لا بد من استخدام الأد...

ATPases هي إنزيمات متكاملة في العديد من العمليات في جميع ممالك الحياة. تعمل ATPases كمحركات جزيئية تستخدم طاقة التحلل المائي ATP لتشغيل تفاعلات متنوعة مثل الاتجار بالبروتين والكشف والتجميع. النسخ المتماثل والنسخ ؛ التمثيل الغذائي الخلوي حركة العضلات؛ حركة الخلية وضخ الأيونات1-3. بعض ATPases عبارة عن بروتينات عبر الغشاء تشارك في نقل المواد المذابة عبر الأغشية ، والبعض الآخر سيتوبلازم وقد يرتبط بغشاء بيولوجي مثل غشاء البلازما أو تلك الموجودة في العضيات.
تشكل فئة AAA + ATPases (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المختلفة) مجموعة كبيرة من ATPases التي تشترك في بعض التسلسل والحفظ الهيكلي. تحتوي هذه البروتينات على أشكال ربط النيوكليوتيدات المحفوظة مثل صناديق Walker-A و -B وتشكل قلات قليلة (بشكل عام سداسيم) في حالتهاالنشطة 1. تم تمييز التغيرات التوافقية الكبيرة في هذه البروتينات عند ارتباط النيوكليوتيدات بين أعضاء متنوعين من عائلة AAA +. EpsE هو AAA + ATPase وعضو في فصيلة فرعية من الإفراز البكتيري من النوع الثاني / الرابع من NTPases4-6. يعمل EpsE على إفراز النوع الثاني (T2S) في ضمة الكوليرا ، العامل المسبب للكوليرا. نظام T2S مسؤول عن إفراز مجموعة متنوعة من البروتينات ، مثل عامل الفوعة سم الكوليرا الذي يسبب الإسهال المائي الغزير عندما تستعمر الكوليرا الأمعاء الدقيقة البشرية7. 
تتنوع تقنيات تقنيات القياس الكمي في المختبر نشاط ATPase ، ولكنها تقيس عادة إطلاق الفوسفات باستخدام ركائز لونية أو فلورية أو مشعة8-11. نصف طريقة أساسية لتحديد نشاط ATPase في المختبر للبروتينات المنقاة باستخدام مقايسة لونية تعتمد على ركيزة تحتوي على أخضر الملكيت المتوفرة تجاريا والتي تقيس الفوسفات غير العضوي المحرر (Pi). عند درجة الحموضة المنخفضة ، يشكل الموليبدات الأخضر الملكيت مركبا مع Pi ويمكن قياس مستوى التكوين المعقد عند 650 نانومتر. يمكن استخدام هذا الاختبار البسيط والحساس لتوصيف ATPases الجديدة وظيفيا وتقييم أدوار المنشطات أو المثبطات المحتملة ، لتحديد أهمية المجالات و / أو المخلفات المحددة ، أو لتقييم تأثير علاجات معينة على النشاط الأنزيمي.

<table><tbody><tr><td>عازلة HEPES</td><td>فيشر</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>فيشر</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)</td><td>فيشر</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>ألواح 96 بئر (شفافة ، مسطحة القاع)</td> <td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>كاشف الكشف عن الفوسفات المفضل. تحذير: مهيج.</td></tr><tr><td>قارئ</td><td></td><td></td> Microplate <td>BioTek Synergy أو</td></tr><tr><td>برنامج</td><td></td><td></td> <td>Prism 5</td> GraphPad</tr> المماثل</tbody></table>

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

الأدينوساين الإنزيمات hydrolyzing ثلاثي الفوسفات، أو ATPases، تلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية. ويمكن لهذه البروتينات ديناميكية توليد الطاقة عن الأعمال الميكانيكية، مثل الاتجار البروتين وتدهور والنقل المذاب، والحركات الخلوية. بروتوكول الموصوفة هنا هو فحص أساسي لقياس النشاط في المختبر من ATPases تنقيته لتوصيف وظيفي. البروتينات يتحلل اعبي التنس المحترفين في رد الفعل الذي يؤدي إلى الإفراج الفوسفات غير العضوية، وكمية من الفوسفات تحرير ثم quantitated باستخدام مقايسة اللونية. هذا البروتوكول العالية للتكيف يمكن تعديلها لقياس النشاط أتباز في المقايسات الحركية أو نقطة النهاية. ويرد بروتوكول التمثيلي هنا على أساس النشاط ومتطلبات EpsE، تشارك AAA + أتباز في النوع الثاني إفراز في بكتيريا ضمة الكوليرا. كمية من البروتين النقي اللازمة لقياس النشاط ومدة الفحص وتوقيت وعدد من سافترات mpling، العازلة وتكوين الملح، ودرجة الحرارة، والعوامل المشتركة، والمنشطات (إن وجدت)، وما إلى ذلك قد تختلف عن تلك المذكورة هنا، وبالتالي بعض التحسين قد تكون ضرورية. يوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا لATPases تميز ويمكن أن يؤديها بسرعة وتعديلها بسهولة عند الضرورة.

النشاط في المختبر من T2S أتباز EpsE يمكن يحفزه copurification من EpsE مع المجال حشوية من EpsL (EpsE-cytoEpsL) وإضافة كارديوليين فوسفورية الحمضية 12. ومن الممكن أيضا لتحديد دور معين بقايا EpsE في اعبي التنس المحترفين المائي من خلال مقارنة النشاط من النوع البري (WT) لأشكال مغايرة من البروتين باستخدام هذا الاختبار. هنا، يتم قياس تأثير استبدال اثنين من مخلفات يسين في المجال ملزم الزنك EpsE بمقارنة النشاط أتباز من تنقية WT EpsE-cytoE...

نصف بروتوكولا أساسيا لقياس نشاط ATPase في المختبر. يمكن تحسين هذا البروتوكول بناء على مستوى النشاط والمتطلبات الخاصة ب ATPase منقى معين.

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير نشاط إنزيم ATPase في المختبر للبروتينات المنقاة من أجل التوصيف الوظيفي. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوصيف إنزيمات ATPase المفترضة الجديدة، وتقييم المنشطات أو المثبطات الفعالة المحتملة، وتحديد مساهمة نطاقات أو بقايا محددة في نشاط ATPase. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة بسيطة وحساسة لقياس نشاط ATPase في المختبر ويمكن تحسينها بسهولة.قم بتحضير مخزونات من جميع الكواشف اللازمة للحضن مع البروتين المنقى وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول النصي. اخلط مسبقاً 100 millimolar من كلوريد المغنيسيوم و100 millimolar من ATP بنسبة واحد إلى واحد مباشرة قبل إعداد تفاعل تحلل ATP مائياً. قم بتحضير وتسمية أنابيب سعة 1.5 milliliter لجمع العينات على فترات زمنية منتظمة طوال فترة التفاعل.جهّز أنابيب لجمع العينات عند الزمن صفر وكذلك عند الدقائق 15 و30 و45 و60. أضف 245 µL من HNG buffer بتركيز 1x إلى كل أنبوب لتخفيف العينات التي تم جمعها من تفاعلات ATP hydrolysis بنسبة تخفيف 1 إلى 50. بعد ذلك، جهّز حماماً من الثلج الجاف والإيثانول لتجميد العينات بسرعة لإيقاف التفاعل.في دلو ثلج مطاطي أو أي حاوية آمنة أخرى، أضف عدة قطع من الثلج الجاف واسكب بعناية كمية كافية من الإيثانول بتركيز 70% إلى 100% لتغطية الثلج الجاف. خفف البروتين المنقى في محلول HNG buffer بتركيز 1X واحفظه على الثلج. قم بتجهيز تفاعلات تحلل ATP في أنابيب سعة 0.5 ملليلتر المعدة مسبقاً عن طريق إضافة حجم محسوب مسبقاً من الماء للوصول إلى حجم تفاعل نهائي قدره 30 ميكرولتر.يتبع ذلك إضافة ستة µL من 5X HNG أو أي محلول منظم آخر، وثلاثة µL من خليط 100 mM من كلوريد المغنيسيوم وATP، ومن 0.25 إلى خمس µM من البروتين. يتم تحضين حالة ضابطة سلبية تحتوي على المحلول المنظم فقط دون إضافة أي بروتين. بعد ذلك، يتم سحب خمس µL من التفاعل عند الزمن صفر.ثم قم بتخفيف الجزء المأخوذ بنسبة 1 إلى 50 في أنبوب 1.5 ملليلتر المُجهّز والذي يحتوي على 245 ميكرولتر من HNG buffer. جمّد العينة فوراً في حمام الإيثانول والثلج الجاف. حضّن التفاعلات عند 37 درجة Celsius للسماح بحدوث تحلل ATP لمدة ساعة واحدة.عند كل فاصل زمني، يتم سحب حصص قدرها 5 µL من التفاعل وإضافتها إلى أنابيب عينات مُصنفة تحتوي على محلول HNG المنظم كما سبق. وفي نهاية تفاعل تحلل ATP المائي، تُنقل العينات المُخففة إلى مجمد بدرجة حرارة 80 درجة مئوية للتخزين. ولضمان تجميد جميع العينات تماماً، انتظر لمدة 10 دقائق على الأقل قبل المتابعة.قم بإذابة العينات المخففة التي تحتوي على حصص من تفاعل تحلل ATP من كل نقطة زمنية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتجهيز طبق ذي 96 بئر يحتوي على العينات ومعايير الفوسفات. في أنبوب سعة 0.5 milliliter، قم بتخفيف معيار الفوسفات من 800 micromolar إلى 40 micromolar عن طريق إضافة 5.5 microliters من المعيار إلى 104.5 microliters من HNG buffer.امزج جيداً وأضف 100 µL من هذا الفوسفات القياسي بتركيز 40 µM إلى البئر A1 في طبق الـ 96 بئراً. أضف 50 µL من منظم HNG إلى الآبار من B1 إلى H1 لإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة واحد إلى واحد للفوسفات القياسي. انقل 50 µL من الفوسفات بتركيز 40 µM من البئر A1، وأضفها إلى 50 µL من منظم المقايسة في البئر B1 ثم امزجهما.بعد ذلك، قم بسحب 50 µL من البئر B1 وأضفها إلى البئر C1، مع الاستمرار في إجراء التخفيفات وصولاً إلى البئر G1. تخلص من 50 µL من البئر G1 بعد الخلط لضمان تماثل الحجم في كل بئر. يجب أن يحتوي البئر H1 على المحلول المنظم فقط لإنشاء معيار فوسفات يتراوح من 40 إلى صفر µM. بعد ذلك، أضف 50 µL من كل عينة في مكررات ثنائية إلى الطبق.أضف العينات المأخوذة من النقطة الزمنية نفسها في أعمدة رأسياً، والعينات من نقاط زمنية مختلفة أفقياً. يتيح ذلك إضافة ما يصل إلى ثماني عينات وخمس نقاط زمنية لكل طبق. استخدم ماصة معقمة لسحب كمية كافية من كاشف الكشف malachite green meliptate phosphate لإضافة 100 µL إلى كل من الآبار التي تحتوي على العينات والمعايير.أضف كاشف الكشف إلى طبق لتسهيل عملية السحب باستخدام ماصة متعددة القنوات. لا تسكب كاشف الكشف مباشرة في الطبق لتجنب حدوث تلوث بالفوسفات. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من كاشف الكشف عن الفوسفات إلى كل بئر، وامزج بعناية عن طريق السحب والطرد لعدد مرات ثابت دون إدخال فقاعات هواء، مع العمل بترتيب عكسي من النقطة الزمنية الأخيرة وصولاً إلى النقطة الزمنية الأولى.اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة أو وفقاً لتوجيهات الشركة المصنعة. ولتقدير النتائج كمياً، قم بقياس الامتصاصية للعينات عند 650 نانومتر باستخدام قارئ ميكرو-لوحات الامتصاصية. تظهر النتائج الممثلة لإنزيمات ATPases الحركية والنهائية، حيث يتم تحديد نشاط الأشكال البرية والمطفرة من إنزيم ATPase/EPSE الخاص بالإفراز من النوع الثاني في وجود وغياب محفز الكاردوليبين.تظهر هنا نتائج قياس حركية إنزيم ATPase المحفز بالكارديوليبين، مما يوضح التحرر الخطي للفوسفات بمرور الوقت لبروتين EPSE من النوع البري وطفرة مزدوجة في الليزين، مع استخدام ألبومين المصل البقري كضابط سلبي. ويمكن تمثيل هذه البيانات على أنها كمية الفوسفات المتحررة في الدقيقة مقسومة على تركيز البروتين من أجل قياس ومقارنة نشاط ATPase لكل بروتين. وتشير البيانات إلى أن بقايا الليزين K417 وK419 تساهم في نشاط ATPase لبروتين EPSE المحفز بالكارديوليبين.تُظهر مقارنة نشاط ATPase لنفس البروتينات دون تحفيز بالكارديوليبين أن بقايا الليسين هاتين لا تساهمان في النشاط الأساسي المنخفض لـ EPSE، بل في قدرة البروتين على التحفيز بواسطة الكارديوليبين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير نشاط ATPase للبروتينات المنقاة بسرعة ودقة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة حساسية كاشف الكشف عن الفوسفات.لتجنب التلوث بالفوسفات، نوصي باستخدام الأدوات البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والمياه فائقة النقاء، وإجراء كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي أو التبادل الأيوني بعد تنقية البروتين.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوصف أسلوب لتحديد النشاط كيناز خلات. هذا الاختبار يستخدم لتحديد رد الفعل المباشر لنشاط إنزيم وحركية كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات مع يقبلون فسفوريل مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمعايرة الفوسفات الاسيتيل أخرى أو أسيتيل التميم استخدام الانزيمات.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

ويرد وصف آثار تفعيل نظائر الانزيمات بروتين كيناز (بي كي سي) C على وظائف الميتوكوندريا المرتبطة التنفس والفسفرة المؤكسدة وعلى بقاء الخلية. النهج يتكيف تقنية الغدانية إلى overexpress انتقائي نظائر الانزيمات PKC في الثقافة الخلية الأولية ومجموعة متنوعة من فحوصات لتحديد وظائف الميتوكوندريا والطاقة حالة من الخلية.

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

يوضح هذا الفيديو مقايسة إنزيم قائم على الكروماتوغرافيا ذات طبقة رقيقة لتحديد نشاط البيروفوسفوكيناز باستخدام النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية. توفر الطريقة نظرة ثاقبة لتخليق النيوكليوتيدات وتفاعلات نقل الفوسفور.

فحص نشاط الإنزيم القائم على كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة: تقنية لتحديد نشاط بيروفوسفوكيناز في المختبر باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

يوضح هذا الفيديو القياس في المختبر لنشاط الإنزيم ل α-galactosidase A وحمض α-glucosidase في العينات باستخدام ركائز 4-Methylumbelliferyl الاصطناعية.

القياس في المختبر لنشاط إنزيم α-Galactosidase A وحمض α-جلوكوزيداز

&lt; p class = "jove_content"&gt; نصف طريقة لتحديد نشاط ATPases من النوع P من K + المضاد عن طريق التعبير غير المتجانس للإنزيمات في بويضات Xenopus وقياس امتصاص Rb + أو Li + في الخلايا الفردية عن طريق القياس الطيفي للامتصاص الذري. هذه الطريقة هي بديل حساس وآمن لتجارب تدفق النظائر المشعة التي تسهل الدراسات الحركية المعقدة.

قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات بواسطة الامتصاص الذري الطيفي: بديل لفحوصات النظائر المشعة

&lt; p class = 'jove_content'&gt; هنا نصف المقايسات الكيميائية الحيوية التي يمكن استخدامها لتوصيف إنزيمات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP لقدراتها على 1) تحفيز انزلاق النيوكليوسوم المعتمد على ATP ، 2) الانخراط مع ركائز النيوكليوسوم ، و 3) تحلل ATP بطريقة تعتمد على النيوكليوسوم أو الحمض النووي.

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

يصف التقرير الحالي مقايسة إنزيمية في المختبر لقياس نشاط ميثيل ترانسفيراز الفوسفاتيديلين إيثانولامين باستخدام مستخلصات خلايا الليشمانيا. يعتمد هذا الاختبار على نقل مجموعة الميثيل المشعة من S- [Methyl-3H] adenosyl-L-methionine إلى phosphatidylethanolamine الذاتية.

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة "المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.

في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي

هنا، يمكننا وصف طريقة لتنقية الإنزيمات معلم الحامض الأميني بيروفوسفوكيناسي واستخدام طبقة رقيقة اللوني من ركائز راديولابيليد ومنتجات الاعتداء للنشاط الأنزيمي في المختبر. مقايسة نشاط إنزيم قابل للتطبيق على نطاق واسع لأي كيناز، cyclase النوكليوتيدات، أو رد فعل الفوسفور ونقل إليه الذي يتضمن التحلل ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات.

تنقية و في المختبر نشاط الإنزيم (ع) بجب سينثاتيز من المطثيّة العسيرة

وقد تم تكييف فحص أدينوكليوتيد أدينين (NADH) المقترنة ATPase لفحص الإنتاجية شبه العالية من مثبطات الموسين جزيء صغير. يتم تشغيل هذا التقييم الحركي في شكل لوحة دقيقة 384 جيدا مع أحجام التفاعل الكلي من 20 ميكرولتر فقط لكل بئر. يجب أن تكون المنصة قابلة للتطبيق على أي إنزيم منتج من ADP تقريبًا.

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

تعلم قياس نشاط الأتباز في المختبر للبروتينات النقية لتوصيفها الوظيفي. تُستخدم هذه الطريقة لتقييم المنشطات أو المثبطات المحتملة ودراسة مساهمة النطاقات في النشاط الأنزيمي.

قياس

استكشف المزيد من الفيديوهات