Name: التصوير الكالسيوم في ذبابة الفاكهة في تنشيط البيض (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: تعلم تصوير الكالسيوم في ذبابة الفاكهة أثناء تنشيط البيض باستخدام بروتوكول خارج الجسم. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميات الكالسيوم بدقة عالية في علم الأحياء التنموي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لورا بامبتون، أليكس ديفيدسون، ريتشارد بارتون، Arita أتشاريا للحصول على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة. ماريانا Wolfner لمناقشة تفعيل البيض. مات ايلاندز لدعم التصوير. ونان هو جين تاو عن الدعم العام في المختبر. وأيد هذا العمل من قبل جامعة كامبريدج، للرماية لTTW [منحة رقم 097814].

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. الاستعداد للتشريح ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للE. Gavis، جامعة برينستون وويل آخرون. آل 18. نفذ الخطوات التالية قبل يومين من التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ قنينة الطيران التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل من المواد الغذائية الصلبة وإضافة كمية صغيرة من الخميرة المجففة إلى زاوية واحدة، وأقل من 1 غرام كافية. ملاحظة: للحصول على معلومات حول قارورة ذبابة أو الطعام انظر &quot;الصيانة ذبابة الفاكهة&quot; 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-3 قطرات من الماء لترطيب الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قارورة جانبا في زاوية 45 درجة والسماح 3-5 دقيقة لخميرة لتناول الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخميرة يمتص الماء، حدد زجاجة من الذباب معربا عن UASt- MYR GCaMP5 20 يقودها حوض-VP16GAL4 (المشار إليها باسم GCaMP5) التي ظهرت في الآونة الأخيرة (أ myristoyوقد تم اختيار النموذج ذا الصلة من GCaMP5 لتوفير إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء من خلال الربط في GECI إلى الغشاء في البيضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب في زجاجة مع غاز ثاني أكسيد الكربون 2. تأكد للحفاظ على زجاجة المقلوب حتى لا تفقد الذباب في الغذاء الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح الذباب تخدير على وسادة CO 2 ونوع 10-15 إناث و 5 ذكور باستخدام الفرشاة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: من هو المعيار ليشمل الذكور إلى الإناث توفير صحية للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما القارورة من الخطوة 1.3 جاهزة، إضافة الذباب المحدد إلى القارورة. احرص على إبقاء الأفقي قارورة حتى تصبح الذباب النشطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 36 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الذباب المتبقية من لوحة CO 2 إلى زجاجة أو تجاهل. </li></ol> 2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للويل وآخرون. الله. <sتصل&gt; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 36 ساعة، تخدير الذباب من القنينة yeasted مع CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تخدير الذباب داخل القارورة نصيحة لهم على لوحة CO 2 يمكن فرزها مع فرشاة الطلاء تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل اثنين من المبيضين من الإناث. لبروتوكول مفصلة الكامل نرى ويل آخرون. آل 18. باختصار: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون المؤكسج (سلسلة 95) على رقم 1.5، 22 × 40 مم ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الأنثى مع ملقط في الجزء الأمامي من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الأنثى تحت المجهر تشريح، استخدم مجموعة ثانية من ملقط لإزالة بلطف الخلفي من الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمحو النسيج الخلفي من ملقط الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط على تجويف البطن مع ملقط الثانية من الجزء الأمامي إلى الخلفي من البطن. يجب المبايض مبهمة اثنين التمسك ملقط عند الخروج من الاناثجنيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمس المبيضين في الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي نوع من الأنسجة من ملقط من قبل محو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوات (2.4.1 - 2.4.7) للحصول على ثلاثة coverslips، كل المبايض تحتوي على من ذبابة واحدة. </li></ol></li></ol> 3. عزل الأفراد الناضجة البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح القياسية مع التكبير المقرر أن 4X، على ساترة الأولى من الخطوة 2.4، فصل اثنين من المبيضين عن طريق تمزيق قناة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض زوج من ملقط مغلقة في وسط المبيض واحد، مع الحرص على عدم ثقب أي غرف البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج التحقيق تشريح القياسية في وسط المبيض بجانب ملقط مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف التحقيق تشريح عن طريق المبيض نحو القطب الخلفي، حيث توجد البيض نضجا (المرحلة 14 غرف البيض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،4 2-5 مرات اعتمادا على حجم المبيض وعدد من البيض. ملاحظة: إضافة CO 2 </فرعية&gt; عادة ما يسبب ترسب بويضة واحدة والتي سوف تظهر أكبر مع الزوائد ظهري أثار من البيض أودعت مسبقا. يجب التخلص من هذه البويضة للتصوير لأنه قد تم تفعيلها داخل الأنثى. ملاحظة: من المحتمل أن تفصل بسهولة من النسيج الضام المبيض البيض الناضجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك البيض نضجا مرئية خارج المبيض، ومواصلة بلطف إغاظة مع لجنة التحقيق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة البيض نضجا واضحة على ساترة خارج المبيض، والمناورة 3-5 في خط في وسط ساترة. ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتشغيل التحقيق بلطف على طول الجانب من البيض. ملاحظة: تجنب سحب على الزوائد الظهرية وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف البيض. ملاحظة: اعتمادا على التصوير في المستقبل انشاء، محاذاة البيض حوالي 200 ميكرون وبصرف النظر عمودي على ساترة لمنطقة التصوير القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الانحياز، وإزالة ما تبقى من أنسجة المبيض عن طريق سحبه بعيدا عن البيض الانحياز استخدام وorceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزيت الزائد بواسطة اللمس مع زاوية مسح لفحص طبي. يجب الحرص على عدم لمس البيض ناضجة مع الطبية مسح البيض الناضجة التي يتم الاتصال بها سوف تضيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم التقاطع على ساترة مع علامة لتبسيط تحديد العينة تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ساترة في مكان آمن وترك الدوائر البيض مستعدة على ساترة للراحة لمدة 5-10 دقائق. وهذا يسمح للبيضة ليستقر في مجال النفط. عينات يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ساعة بعد تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،11 لبقية لل coverslips مع المبايض عليها. </li></ol> 4. إعداد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب عازلة تفعيل استعداد 15 إلى درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: عازلة التنشيط هو العازلة منخفض التوتر: 3.3 ملي ناه 2 ص 4، 16.6 ملي KH 2 PO 4، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 5٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000، 2 مم CaCl 2، جلبت لدرجة الحموضة 6.4 مع 1: 5 نسبة هيدروكسيد الصوديوم: KOH.لمزيد من المعلومات راجع Mahowald، 1983 15. أجزاء مأخوذة من العازلة التنشيط يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة أشهر، وعند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية نقل coverslips مستعدة العازلة التنشيط والماصات الزجاجية إلى مرفق التصوير. ملاحظة: A-حقل واسع، متحد، القرص الغزل أو ضوء المجهر ورقة يمكن استخدامها. نحن نوصي باستخدام مجهر مقلوب. وقد تم الحصول على نتائجنا تمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي اختيار هدف مناسب لتصوير البويضة الناضجة بأكمله (هنا: 20X 0.7 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب أول ساترة المعدة إلى المرحلة المجهر. الحرص على عدم كسر لل coverslips على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعيا تحديد مجال الرؤية مع غرفة بيضة ناضجة من أجل التنشيط. لا صورة ثقب غرف البيض أو تلك مع blebbing في الغشاء. ملاحظة: للحصول على خطوات 4،6-4،7، وأوامر البرنامج تختلف تبعا المجهر والشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الفقرة التصويرمتر عن الإثارة القياسية GFP (488 نانومتر) والانبعاثات (500-580 نانومتر). كذلك وضعت وجهة نظر مشرق الميدان من أجل رؤية وتوجيه البويضة الناضجة والنفط النازحين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار أقل Z-الطائرة حيث البيض نضجا واضحة ووضع كامل Z-كومة الواجب اتخاذها لمدة 40 ميكرون في ما يقرب من 2 ميكرون لكل خطوة. تعيين المعلمات حتى لا يكون هناك أي تأخير بين اكتساب Z-المكدس. تعيين سلسلة من الوقت لالتقاط ما يقرب من 30 دقيقة. </li></ol> تفعيل 5. التصوير فيفو السابقين البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 1-2 كامل Z-المداخن التي سيتم اكتسابها. وهذا يدل على البويضة الناضجة قبل التنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ما يقرب من 300 ميكرولتر من العازلة التنشيط إلى ماصة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المواقع غيض من ماصة زجاجية تحتوي عازلة تفعيل بزاوية 45 درجة فوق ساترة، تتحرك ببطء ماصة في مسار الشعاع حتى يتم مباشرة فوق البويضة الناضجة التي يجري تصويرها. ماصة الزجاج ينبغييكون 1-2 سم فوق الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 قطرات من العازلة التنشيط في أقل من 5 ثوان من ماصة الزجاج. وهذا ينبغي أن تحل محل النفط. تجنب إضافة عازلة تفعيل الزائد أو لمس البيض مع ماصة الزجاج لأنها يمكن أن تسبب تشريد البويضة الناضجة. والحرص على عدم لمس ساترة مع ماصة وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغيير في الطائرة أو فقاعات الهواء التنسيق لتشكيل في مجال النفط الغمر بين الهدف وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين مضيفا عازلة تفعيل خلال الحصول على الصور، والتحقق من قناة مشرق الميدان للتأكد من أن النفط قد نزحوا من المنطقة العازلة التنشيط. ملاحظة: سوف تظهر هذه الجملة لأول مرة كما ظل بسبب ماصة كسر مسار الشعاع ولكن سوف يؤدي أيضا إلى ظهور قطرات النفط الصغيرة. يمكن أن تبقى بعض قطرات النفط المرتبطة البويضة الناضجة التي سوف تؤثر على النتائج التجريبية وجودة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يتم النازحين النفط من إضافة الأولية من تكرار عازلة تفعيل الخطوات 5،4-50.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد النازحين النفط بنجاح، والسماح للسلاسل الزمنية لتشغيل حتى الانتهاء. ملاحظة: نظرا لتورم من البويضات في التنشيط، وبعض الدوائر البيض تتحرك بشكل كبير من المستوى البؤري أو مجال الرؤية على إضافة عازلة التنشيط. في هذا الوضع، والتوقف عن اقتناء وتركيب ساترة المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال تسلسل الحصول على الصور، وحفظ البيانات. </li></ol> 6. بعد اكتساب معالجة الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مجموعة البيانات باستخدام فيجي (http://fiji.sc/Downloads#Fiji)، أو ما يعادلها برامج معالجة الصور، وحدد الملفات ذات الصلة لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء الإسقاط من البيانات التي حصل عليها تحديد: صورة&gt; الأكوام&gt; Z المشروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بداية Z-شريحة ووقف Z-شريحة، وعادة الفرع بأكمله. اختر نوع الإسقاط، عادة لمجموعة &#39;كثافة ماكس &quot;. خانة علامة &#39;كل الأطر الزمنية &quot;لتطبيق الإعدادات المحددة إلى سلسلة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذاوقد تم تصوير أكثر من قناة واحدة الفلورسنت، استخدم أداة القنوات لتمكين التنقل بين الألوان، وجعل المركبة، أو جعل الرمادي صورة. صورة مختارة&gt; الألوان&gt; القنوات الأداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط سطوع الصورة وعلى النقيض اختر صورة&gt; ضبط&gt; السطوع / التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصدير صورة واحدة، نقل المنزلق الزمني لإطار ذات الصلة، وحدد ملف&gt; حفظ باسم&gt; الحياة السياسية في فرنسا، أو أي شكل المفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. سوف نلاحظ معدل الإطار من برامج التصوير تكون هناك حاجة لإعطاء الطابع الزمني على الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير سلسلة زمنية كفيلم حدد: ملف&gt; حفظ باسم&gt; AVI، ثم حدد معدل الإطار (~ 7 إطارات في الثانية الواحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ الملف المعدل في شكل فيجي، حدد ملف&gt; حفظ. </li></ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا البروتوكول هي عزل البويضات الناضجة دون ضرر. يمكن تحقيق ذلك عن طريق مناورة غير اليهودي للبيض باستخدام مسبار التشريح. ستمكن الممارسة من تنفيذ هذا التلاعب دون الإضرار بالبويضات. الخطوة الثانية الحاسمة هي تجنب فقدان العينة عند تطبيق مخزن التنشيط على البيضة الناضجة في الزيت. يجب أن يتم تطبيق المخزن المؤقت للتنشيط ببطء ودون ملامسة الغطاء. قد تكون هذه الخطوة صعبة إذا كان إعداد المجهر لا يسمح بالوصول السهل إلى العينة. ينصح بنقل الأجزاء الإبطية من المجهر ، مثل حاضنة درجة الحرارة. 
يمكن إجراء تعديلات على هذا البروتوكول من أجل تصور العوامل الأخرى الموسومة بالفلورسنت ، بدلا من Ca2+ عند تنشيط البيض. بشكل عام ، يمكن تحليل المراحل المختلفة من تطور ذبابة الفاكهة أو نتائج إضافة مخزن مؤقت مختلف باستخدام هذا البروتوكول. 
قد تكون هناك حاجة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا لم تكن الإعدادات الموجودة على المجهر مثالية لتصور الإشارة من العينة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق زيادة أو تقليل طاقة الليزر ، وتغيير نطاق الالتقاط وضبط معلمات Z-stack. قد تكون مشكلة أخرى هي خروج البيض باستمرار من مجال الرؤية عند إضافة مخزن مؤقت للتنشيط. إذا حدث هذا بانتظام ، اترك البيض الناضج يستقر على الأغطية لفترة أطول من الوقت ، من 15 إلى 20 دقيقة. احذر من أن استخدام زيت عالي اللزوجة سيغير إزاحة الزيت عن طريق التنشيط العازل. 
هذه التقنية المعروضة هنا محدودة بمسافة العمل للهدف ، وجفاف البويضات الناضجة والقدرة على تشريح البويضات الناضجة دون ضرر. ومع ذلك ، عند مقارنتها بطرق التصوير في الجسم الحي حيث تمر البويضة الناضجة عبر الأنثى البالغة وتترسب 13 ، فإن طريقتنا تتيح المزيد من الدقة المكانية ، وخيار التلاعب الجسدي بالبويضة الناضجة قبل التنشيط والقدرة على اختبار دور تنشيط البويضة دون الإخصاب. 
هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة لهذه التقنية ، بما في ذلك اختبار تركيبات المراسل للمكونات الخلوية عند تنشيط البويضة وتصور موجة Ca2+ في خلفيات متحولة 14،24. جنبا إلى جنب مع الأدوات التجريبية والوراثية ، يتيح اختبار تنشيط البيض خارج الجسم الحي المقدم هنا دراسة الزناد والانتشار والتأثيرات النهائية لموجة Ca2+ المحفوظة عالميا.

أي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيز على البيض (البويضة) تفعيل عنصرا المحافظ في جميع الكائنات درس 1،2. هذا الحدث يبدأ مجموعة واسعة من العمليات معتمد على الكالسيوم 2+، بما في ذلك استئناف دورة الخلية وترجمة من mRNAs المخزنة. وكان نتيجة لهذا الشرط ل Ca 2+، تصور التغييرات عابرة في الخلايا تركيزات الكالسيوم 2+ من الفائدة الرئيسية. تاريخيا، تم اختيار الكائنات نموذج للدراسات على تفعيل البيض على أساس حجم ومدى توافر بيضها. وقد تم استخدام نهج التصور المختلفة لمتابعة وقياس التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التركيزات في هذه الأنظمة، بما في ذلك: aequorin photoprotein في الأسماك الميداكا 3؛ كاليفورنيا الأصباغ الفلورية الحساسة 2+ مثل FURA-2 في قنفذ البحر والهامستر 4،5. والكالسيوم الأخضر-1-ديكستران في القيطم 6. حولت توليد وتحسين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) القدرة على تصور كا 2+ ديناميكية في الجسم الحي 7. يتم التعبير عن هذه التركيبات الوراثية في أنسجة معينة وتحد من الحاجة إلى الاستعدادات الأنسجة الغازية 8. GCaMPs هي بروتين فلوري (GFP) فئة المستندة الخضراء GECIs التي كانت فعالة جدا بسبب بهم عالية الكالسيوم 2+ تقارب، نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقدرة على تخصيص 9-11. في وجود الكالسيوم 2+، مجمع GCaMP يخضع لسلسلة من التغييرات متعلق بتكوين، بدءا من الربط من الكالسيوم 2+ لكالمودولين، أن النتائج في زيادة كثافة الفلورسنت من عنصر GFP 9. وقد استخدمت GCaMPs نطاق واسع في الأبحاث على الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة لرؤية التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا 12. في تطبيق والأخيرةعلى التكنولوجيا GCaMP لتصور كا 2+ في البيض ذبابة الفاكهة الناضجة قد كشفت عن وجود واحدة عابرة الكالسيوم 2+ موجة في تنشيط البويضة 13،14. يمكن تصور موجة الكالسيوم 2+ في تضخم منخفض خلال الإباضة في الجسم الحي 13 أو في أعلى التكبير باستخدام المجراة سابقا تفعيل الفحص 13،14. في مقايسة خارج الجسم، يتم عزل البويضات الناضجة من المبيض الفردية وتفعيلها باستخدام محلول منخفض التوتر، ويشار إلى عازلة التنشيط، وهو ما ثبت لتلخيص أحداث في الجسم الحي تفعيل 15-17. هذا الاختبار خارج الحي تمكن من السهل عالية الدقة تصور كا 2+ موجة تحت ظروف تجريبية مختلفة بما في ذلك تعطيل الدوائية، التلاعب المادية والمسوخ الوراثية. توضح هذه المقالة إعداد البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لالسابقين تنشيط الجسم الحي والعشرينالبريد المجهري لاحقة تستخدم لتصور موجة الكالسيوم 2+ باستخدام GCaMP. هذا النهج يمكن استخدامها لاختبار بدء والسيطرة على موجة الكالسيوم 2+ وتحقيق النتائج النهائية.

<table><tbody><tr><td>الخميرة الجافة النشطة</td><td>فليشمان s</td> <td># 2192</td><td></td></tr><tr><td>تشريح المجهر</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>ستعمل مختلفة</td></tr><tr><td>مصباح</td><td>Mircotec الألياف البصرية</td><td>MF0-90</td><td>ستعمل مختلفة</td></tr><tr><td>مناديل طبية</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>قلم تحديد</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen عالمي ، أسود - متوفر في معظم المتاجر الثابتة. عرض دقيق 0.4 مم</td></tr><tr><td>CO2 pad</td> <td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>زلة الغطاء رقم 1.5 ، 22 × 50 مم</td><td>دولي- No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T & nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>زيت الهالوكربون ، سلسلة 95</td><td>شركة منتجات الهالوكربون.</td><td>الموزع في أوروبا:</td><td></td></tr> <tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>يمكن استخدامها بدلا من زيت الهالوكربون ، سلسلة 95</td></tr><tr><td>Fulps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>في حين أن هذه الأداة يجب أن تكون نظيفة ، فإن استخدام الأوتوكلاف ليس ضروريا ، فالإيثانول سيكون كافيا.</td></tr><tr><td>مسبار</td><td>أدوات العلوم</td><td>الدقيقة 10140-01</td><td></td></tr><tr><td>ماصة زجاجية</td><td>فيشربراند ،</td> <td>FB50251</td><td>ماصات باستور ، زجاج ، غير متصل ، طول 150 مم &nbsp ؛</td></tr><tr><td>قارورة</td><td>ريجينا للصناعات</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 مم × 25 مم</td></tr></tbody></table>

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

تنشيط البويضة هو عملية عالمية تتضمن سلسلة من الأحداث للسماح للبويضة المخصبة بإكمال الانقسام الاختزالي وبدء التطور الجنيني. أحد جوانب تنشيط البويضات ، المحفوظة في جميع الكائنات الحية التي تم فحصها ، هو التغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2+) الذي يطلق عليه غالبا اسم "موجة Ca2+". في حين أن سرعة وعدد تذبذبات موجة Ca2+ تختلف بين الأنواع ، فإن التغيير في Ca2+ داخل الخلايا هو المفتاح في إحداث الأحداث الأساسية للتطور الجنيني. تشمل هذه التغييرات استئناف دورة الخلية ، وتنظيم mRNA ، وإفراز الخلايا الحبيبية القشرية ، وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي.
 في ذبابة الفاكهة الناضجة ، يحدث التنشيط في قناة البيض الأنثوية قبل الإخصاب ، مما يؤدي إلى سلسلة من الأحداث المعتمدة على Ca2+. نقدم هنا بروتوكولا لتصوير موجة Ca2+ في ذبابة الفاكهة. يوفر هذا النهج نظاما نموذجيا قابلا للتلاعب لاستجواب آلية موجة Ca2+ والتغيرات النهائية المرتبطة بها.

هنا لقد أثبتنا كيفية تحضير البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لتفعيل خارج الحي. البيض تعبر عن GECI تمكين التصوير من الكالسيوم 2+ ديناميكية في تنشيط البويضة وبداية التطور الجنيني (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أن الاعتماد على GCaMP المستخدمة، وتحديدا وجود مجموعة myristoyl، قد يكون لها نتائج اختلافات نوعية طفيفة 13 14. لقد أثبتنا أيضا دور للالأكتين وظيفية خلال تفعيل البيض من خلال إضافة المانع من بلمرة الأكتين، مثبط حركة الخلايا D، إلى المخزن المؤقت تفعيل (الشكل 2) 14. وحفظها ومتطلبات الهيكل الخلوي في تنشيط البويضة. في C. ايليجانس بعد الإخصاب، وإعادة تنظيم مكونات هيكل الخلية لإعداد الجنين خلية واحدة لدوري الدرجة الاولى غير متناظرة 21،22. في قنفذ البحر وانقطاع cytoskeleوقد تبين التل إعادة تنظيم التالية تفعيل تؤثر على دورة الخلية عن طريق منع مقلص تشكيل حلقة 23. يبقى دور الأكتين في التوسط موجة الكالسيوم 2+ وظيفة المصب لها في تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة إلى أن توضح تماما. في ذبابة الفاكهة، وشارك في تصور كا 2+ موجة والأكتين الهيكل الخلوي يمكن تحقيقه باستخدام هذا خارج الحي تفعيل الفحص. سلسلة زمنية من قنوات متعددة يمكن الحصول عليها وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يمكن أن تتطابق مع التغييرات في المؤسسة الأكتين في البويضة (الشكل 3). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> الشكل 1: واحدة الكالسيوم 2+ موجة في سلسلة ذبابة الفاكهة البيض وقت التنشيط من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 بعد لddition العازلة تفعيل (ه). ارتفاع الكالسيوم حشوية 2+ ينشأ في القطب الخلفي (B) ويكاثر (BF) مع سرعة متوسط ​​ما يقرب من 1.5 ميكرون / ثانية. وعادة ما لوحظ بدء موجة بعد 3 دقائق من إضافة العازلة التنشيط. بعد التنشيط، ومستويات الكالسيوم داخل الخلايا من البويضة الناضجة ترجع إلى ما قبل تفعيل مستويات (G، H). رؤية فيلم التكميلي 1 (مجموع الوقت 33 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> الشكل 2: إضافة مثبط حركة الخلايا D لتنشيط العازلة يشوش كاليفورنيا2+ انتشار الموجات. السلاسل الزمنية من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 التالية إضافة عازلة تفعيل تحتوي على 10 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D التركيز النهائي (ه). في حين يتم بدء 2+ موجة الكالسيوم في القطب الخلفي (A)، وخطر ذلك ولا تصل الأمامي من البيضة (F) (السهام البيضاء للدلالة على جبهة الموجة). أبعد وقد لوحظت تغييرات الكالسيوم 2+ أكثر من 30 دقيقة). رؤية فيلم التكميلي 2 (مجموع الوقت 30 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> الشكل (3): شارك في التصور أكتين والكالسيوم 2+ في Eتفعيل زز في سلسلة ذبابة الفاكهة. وقت خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 (سماوي) وUASp -F-Tractin.tdTomato (أرجواني) بعد إضافة عازلة تفعيل (ه). و2+ موجة الكالسيوم يبادر من القطب الخلفي وتسترد كما في الشكل 1. يبدو أكتين أن تغيير مع مرور الوقت، السهام البيضاء (A مباراة H). ومن المقرر أن تنقل العينة أثناء التقاط الصور لعدم وجود الكالسيوم 2+ الكشف عن إشارة في وسط البويضة الناضجة. الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

إن الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الكالسيوم أثناء تنشيط البويضة في ذبابة الفاكهة (Drosophila melanogaster). ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محورية في علم الأحياء النمائي، مثل تحديد مصدر الكالسيوم وديناميكياته وأدواره اللاحقة عند تنشيط البويضة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في السماح بدقة مكانية أعلى، وإمكانية المعالجة الفيزيائية للبويضة الناضجة قبل التنشيط، واختبار دور تنشيط البويضة دون الحاجة إلى الإخصاب.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في عزل البويضات الناضجة دون إتلافها، وفي تطبيق محلول التنشيط على البويضة الناضجة دون فقدان العينة. لبدء هذا الإجراء، اضبط قوة تكبير المجهر التشريحي على 4X. وعلى الشريحة الغطائية الأولى، افصل المبيضين عن طريق تمزيق قناة البيض باستخدام ملقط مغلق ومسبار تشريح، مع الحرص على عدم ثقب أي من غرف البويضات.بعد ذلك، أدخل مسبار تشريح قياسي في مركز المبيض، بجوار الملقط المغلق. اسحب مسبار التشريح برفق عبر المبيض، باتجاه القطب الخلفي، حيث تقع البويضات الناضجة. وبمجرد ظهور البويضات الناضجة على غطاء الشريحة خارج المبيض، قم بتوجيه ثلاث إلى خمس بويضات منها لتصبح في خط واحد في المركز.بعد ذلك، قم بإزالة بقية أنسجة المبيض عن طريق سحبها بعيداً عن البويضات المصطفة. ثم، قم بإزالة الزيت الزائد عن طريق التربيت عليه بزاوية منديل طبي. ارسم علامة تقاطع على شريحة التغطية باستخدام قلم تحديد لتحديد موقع العينة تحت المجهر.بعد ذلك، اترك غرف البيض المُحضرة على غطاء الشريحة لترتاح لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق للسماح للبيوض بالاستقرار في الزيت. انقل أغطية الشرائح المُحضرة، ومحلول التنشيط بدرجة حرارة الغرفة، والماصات الزجاجية إلى مرفق التصوير. اختر عدسة شيئية مناسبة لتصوير البيضة الناضجة بأكملها.بعد ذلك، قم بتثبيت أول شريحة غطاء مُعدة على منصة المجهر. ثم، اختر مجال رؤية لغرفة بيض ناضجة من أجل التنشيط. اضبط معلمات التصوير الخاصة باستثارة وانبعاث GFP القياسية.بعد ذلك، قم بإعداد عرض المجال المضيء (bright field view) من أجل تصور وتحديد اتجاه البيضة الناضجة والزيت المزاح. الآن، اختر أدنى مستوى Z-plane تكون فيه البيضات الناضجة مرئية. ثم قم بضبط التقاط مجموعة Z-stack كاملة لمسافة 40 micrometers وبمقدار خطوة قدرها 2 micrometers لكل مرحلة.بعد ذلك، اضبط السلسلة الزمنية لالتقاط الصور لمدة 30 دقيقة. في هذا الإجراء، ابدأ التقاط الصور، واجمع واحدة إلى اثنتين من مجموعات Z-stacks الكاملة لإظهار البويضة الناضجة قبل التنشيط. بعد ذلك، اسحب حوالي 300 µL من محلول التنشيط المنظم باستخدام ماصة زجاجية.ضع طرف الماصة الزجاجية التي تحتوي على محلول التنشيط بزاوية 45 درجة فوق غطاء الشريحة، وحرّك الماصة ببطء داخل مسار الشعاع، حتى تصبح فوق البويضة الناضجة التي يتم تصويرها مباشرةً. أضف قطرة إلى قطرتين من محلول التنشيط في أقل من خمس ثوانٍ، وذلك لإزاحة الزيت. يجب إضافة قطرة إلى قطرتين من محلول التنشيط بالزاوية الصحيحة، وبطريقة لطيفة وسريعة.عند إضافة محلول التنشيط أثناء عملية التقاط الصور، تحقق من قناة الحقل المضيء (bright-field) للتأكد من إزاحة الزيت. وبمجرد إزاحة الزيت بنجاح، اسمح للسلسلة الزمنية بالاستمرار حتى الاكتمال. ولإنشاء إسقاط للبيانات المكتسبة، حدد شريحة Z للبداية وشريحة Z للنهاية للقسم بأكمله.بعد ذلك، اختر نوع الإسقاط، على سبيل المثال، الشدة القصوى (maximum intensity). ثم، حدد مربع الاختيار "جميع الإطارات الزمنية" (All time frames) لتطبيق الإعدادات المختارة على السلسلة بأكملها. ولضبط سطوع الصورة وتباينها، اختر "صورة" (Image)، ثم "ضبط" (Adjust)، متبوعة بـ "السطوع/التباين" (Brightness/Contrast).لتصدير السلسلة الزمنية كفيلم، اختر File، ثم Save As، متبوعة بـ AVI. بعد ذلك، حدد معدل الإطارات. يظهر هنا التسلسل الزمني لبيضة Drosophila ناضجة خارج الجسم (ex vivo) تعبر عن مؤشر كالسيوم مشفر جينياً بعد إضافة محلول التنشيط.يبدأ ارتفاع مستويات الكالسيوم في السيتوبلازم من القطب الخلفي، ثم ينتشر بسرعة متوسطة تبلغ حوالي 1.5 micrometers per second. ويُلاحظ عادةً بدء الموجة في غضون ثلاث دقائق من إضافة محلول التنشيط المنظم. وبعد التنشيط، تستعيد البويضة الناضجة مستويات الكالسيوم داخل الخلايا.يمكن تحقيق التصوير المشترك لموجة الكالسيوم والهيكل الخلوي للأكتين في ذبابة الفاكهة (Drosophila) باستخدام مقايسة التنشيط خارج الجسم الحي هذه. يبدو أن الأكتين يتغير بمرور الوقت، كما تشير رؤوس السهام البيضاء. ويرجع عدم اكتشاف إشارة الكالسيوم في مركز البيضة الناضجة إلى تحرك العينة أثناء التقاط الصور.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذ العملية بأكملها في أقل من ساعة، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التمهل عند التعامل مع غرف البيض، وعند ضبط معايير الاستحواذ. يمكن تكييف هذا الإجراء لتصور بروتينات أخرى موسومة فلوروسنتياً، أو عضيات، أو مؤشرات الكالسيوم عند تنشيط البيض.يمكن أن يساعد هذا في معالجة التساؤلات المتعلقة بمصدر الكالسيوم والتأثيرات اللاحقة.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

وصفنا تقنية أنشئت لقياس وتحليل رائحة استجابات الكالسيوم في الفص antennal...

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

يصف هذا الفيديو تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة باستخدام GCaMP. يوضح مقطع البروتوكول المميز كيفية تسجيل التغييرات في مضان GCaMP من الخلايا العصبية لجسم الفطر أثناء تجربة تكييف حاسة الشم.

ذبابة الفاكهة في الجسم الحي تصوير الكالسيوم: طريقة للتصوير الوظيفي للنشاط العصبي

يوضح هذا الفيديو تقنية لتصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية لالتهاب الفلورسنت الذي يتصرف باستخدام بروتينات مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا. يحدد الخطوات المتبعة في تصوير حركة الدودة وقياس نسب التألق المراسل من الخلايا العصبية لربط مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بالنشاط العصبي والتغيرات السلوكية أثناء وضع البيض.

تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية التي تنظم سلوك وضع البيض في Caenorhabditis elegans

المصدر: Ishimoto, H. }et. al.،، تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لتصور استجابات الدماغ لإشارات الغدد الصماء في ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2018) } يوضح هذا الفيديو تصوير الكالسيوم للدراسةذبابة الفاكهة  استجابات الدماغ للببتيدات العصبية. تكشف الخلايا العصبية التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري عن ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا والاستجابات الوظيفية لجزيئات الإشارات.

تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لدراسة استجابات ذبابة الفاكهة للدماغ للببتيدات العصبية

تسمح طريقة التصوير المستقيم الموضحة في هذا البروتوكول بالتصور التفصيلي لأقطاب ذبابة الفاكهة السوداء النامية.  يوفر هذا العرض النهائي منظورا جديدا لترتيبات وأشكال أنواع الخلايا المتعددة في الظهارة المسامية.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الدماغ المورفولوجية . باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تطبيق المركبات الطبيعية أو الاصطناعية إلى المخزن المؤقت لاختبار قدرتها على تنشيط معينة من الخلايا العصبية في الدماغ.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن بروتين جنين ذبابة الفاكهة والحمض النووي الريبي وتوطينهما من الجمع إلى التضمين المسبق والتضمين ، والتلطيخ المناعي ، وتهجين الحمض النووي الريبوزي المرسال في الموقع .

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يوفر البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة للبالغين من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

هنا ، نقدم بروتوكولات وأدوات لتصور الكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور الجنيني المبكر باستخدام مراسل الكالسيوم المشفر وراثيا المعبر عنه في السلالة الجرثومية لنموذج الديدان الخيطية C. ايليجانس.

في الجسم الحي التصور العابرين للكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور المبكر في C. ايليجانس

نقدم بروتوكولات تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الشمية لليرقات ذبابة الفاكهة ، باستخدام مادة لاصقة للأنسجة الموضعية لتثبيت الحركة. تعزز هذه الطريقة الاستقرار ، مما يسهل التجارب الموثوقة في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. تحلل نصوص R المخصصة إشارات الكالسيوم ، مما يوفر منصة فعالة للبحث الفيزيولوجي العصبي التفصيلي.

تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لخلية عصبية الدائرة الشمية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء الطورية الثالثة

تعلم تصوير الكالسيوم في ذبابة الفاكهة أثناء تنشيط البيض باستخدام بروتوكول خارج الجسم. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميات الكالسيوم بدقة عالية في علم الأحياء التنموي.

التصوير الكالسيوم في

استكشف المزيد من الفيديوهات