حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي Ciona المعوية

الهدف العام لتقنيات التعدي العابر في أجنة Ciona هو دراسة تنظيم الجينات والوظيفة المطلوبة لتشكيل الشرغوف مثل اليرقات ، والاستفادة من سلالتها الخلوية الثابتة ، وجينوم اللافقاريات المضغوط ، من أجل اكتساب نظرة ثاقبة على أصول اللافقاريات الحبلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة الجزيئية ، مثل الآليات المحفوظة لبرنامج تطوير الحبل ذي الصلة بأبحاث الخلايا الجذعية ، واكتشاف الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه مع التثقيب الكهربائي للجنين ، يمكنك التعامل مع مئات أو آلاف الأجنة المتزامنة في يوم واحد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب تمزق الجنين الهش ، ولأنه من الصعب تطوير تقنية حقن دقيقة فعالة. ابدأ بتشريح البالغين Ciona في غرفة جنين مبردة بدرجة حرارة 18 درجة مئوية. استخدم مقصا صغيرا لعمل شق في الطرف المقابل من السيفون وعلى جانب السيفون الأقصر ، والذي تمر تحته قناة البيض وقناة المنوية.

إطالة الشق لفضح قناة البيض. ثم استخدم طرف المقص لعمل شق دقيق في قناة البيض. اضغط برفق على قناة البيض بالمقص المغلق وانزع البيض.

اسمح للبيض بالسقوط مباشرة في صفيحة من ستة آبار تحتوي على مياه البحر الاصطناعية مع HEPES. استخدم ماصة باستور ، مغسولة مسبقا ب ASWH ، لجمع ونقل البيض المتبقي. لجمع المنوية ، قم بقطع قناة المنوية بالمقص ، ثم استخدم ماصة باستور منفصلة لجمع المنوية المركزة ، ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتنشيط المنوية عن طريق الجمع بين مليلتر واحد من ASWH و 50 ميكرولتر من Tris في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المنوية المركزة ، وأغلق الغطاء ، واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب ، أو باستخدام ماصة باستور. بعد ذلك ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول المنوية المنشط إلى كل بئر من البيض ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، بحيث تطفو البويضات في الوسط.

ابدأ التقشير عن طريق جمع البيضة الملقحة وتوزيعها في أنابيب زجاجية. باستخدام جهاز الطرد المركزي اليدوي ، قم بتدوير البيضة الملقحة عند اثني عشر مائة مرة G لمدة 20 ثانية تقريبا ، ثم أوقف جهاز الطرد المركزي ببطء. قم بإزالة ASWH من الكريات باستخدام ماصة باستور.

أضف أربعة ملليلتر من محلول إزالة التشخر المنشط إلى الحبيبات في كل أنبوب. قم بتعليق البيضة البيضة الملقحة عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور معالجة بماء الصنبور ، مغطاة بكمثرى مطاطية صغيرة. يجب أن يتحول لون المحلول إلى اللون الأصفر بعد 1 إلى 3 دقائق.

أثناء إزالة التآكل ، قم بإزالة جزء صغير من المعلق المزيل للتشنج باستخدام ماصة باستور. قم بإيداع قطرة على شريحة ، وراقبها تحت المجهر التشريح. ماصة تعليق البيضة الملقحة لأعلى ولأسفل ، وتحقق من الشريحة كل 20 إلى 30 ثانية.

أولا تنفصل خلايا المسام ، ثم تتحول المشيمة إلى اللون الأصفر وغير الشفاف ، وأخيرا تنفصل عن البيضات. سوف تغرق البيضة الملقحة الوردية في قاع الأنبوب الزجاجي. بمجرد أن يتم إزالة أكثر من 50٪ من البيضة الملقحة ، املأ الأنبوب ب ASWH.

جهاز طرد مركزي برفق شديد لمدة 10 إلى 15 ثانية ، وهو ما يكفي فقط لترسيب البيضة الملقحة المتكللة. أوقف جهاز الطرد المركزي ببطء. قم بإزالة كل السائل تقريبا من الأنبوب الزجاجي ، بما في ذلك أي مادة عائمة ، واستبدلها ب ASWH.

الماصة لأعلى ولأسفل لغسلها ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي برفق كما كان من قبل. اغسل مرة أخرى حتى لا يتبقى حطام المشيمة. ترسيب الجاذبية الغسيل إلى البيضة الملقحة المفككة في أنابيب 1.5 ملليلتر من السيليكون.

بعد الترسيب ، قم بإزالة ASWH وصولا إلى علامة 100 ميكرولتر على الأنبوب. استخدم الآن ماصة باستور لإضافة 250 ميكرولترا من الحمض النووي المعد مسبقا في محلول المانيتول إلى أنبوب واحد من البيضة الملقحة. اخلطي الخليط برفق وانقليه على الفور إلى كوفيت كهربائي بسعة أربعة ملليمترات.

ضع الكوفيت في حامل التثقيب الكهربائي ، وأعط نبضة واحدة مدتها 16 مللي ثانية عند 50 فولت. ثم قم بإزالة البيضة الملقحة من الكوفيت باستخدام نفس ماصة باستور ، وطردها في طبق استزراع يحتوي على ASWH طازج ومفلتر. حرك الطبق لنشر البيضة الملقحة.

اشطف الماصة في دورق من ASWH ، ثم انتقل إلى العينة التالية. بعد زراعة جميع البيضة الملقحة ، قم بزراعة البيضة الملقحة على حرارة 15 إلى 20 درجة مئوية. قم بإعداد المعالج الدقيق في غرفة مبردة بدرجة حرارة 18 درجة مئوية.

قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي وحامل الإبرة بحقنة زجاجية سعة 10 مل مملوءة بالزيت المعدني. ردم الأنبوب وحامل الإبرة بالزيت ، وطرد أي فقاعات هواء. أدخل إبرة الحقن التي تحتوي على 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن مع صبغة حيوية خضراء في حامل الإبرة.

ووضع الحامل على المناور الدقيق. اضبط حامل الإبرة بحيث يتحرك على طول خط مستقيم بزاوية 45 درجة بالنسبة للسطح. قم بتوجيه البيض المكسورة في طبق ثقافة صغير مغطى بالأغروز على طول المسافة البادئة ، بحيث يمكن حقن البيض واحدا تلو الآخر تحت مجهر التشريح.

إذا لزم الأمر ، قم بكسر طرف الإبرة عن طريق دفع الإبرة برفق على قطعة من زلة الغطاء الزجاجي ، موضوعة على الاغاروز. اضغط قليلا للتحقق من أن طرف الإبرة مفتوح. حقن البويضات غير المخصبة واحدة تلو الأخرى ، عن طريق إدخال الإبرة أولا في البويضة ، والشفط قليلا لكسر غشاء البويضة.

ثم قم بحقن محلول الحقن الأخضر في منتصف البويضة بحد أقصى ثلث قطر الخلية. بعد حقن كل البويضات ، قم بإزالة الإبرة ، وانقل البيض المحقون غير المخلب إلى طبق استزراع طازج ، واحتضانه عند 15 إلى 18 درجة مئوية حتى الإخصاب. تم استخدام الحقن المجهري لدراسة تنظيم عامل نسخ المايلين Ciona intestinalis أو MyT في مرحلة المعدة من أجنة Ciona.

مراقبته عن طريق التهجين الموضعي ، ويلاحظ تعبير داخلي في سلائف الصفيحة العصبية في الصف السادس في النوع البري. الحقن الدقيق للمورفولينوس للقضاء على العوامل الجنينية المبكرة ، مثل صندوق Forkhead A ، وهو عامل نسخ ، يلغي التعبير العام ل MyT. على العكس من ذلك ، يتم تنشيط تعبير MyT خارج الرحم عند التنظيم السفلي للعقدة ، مما يشير إلى أن العقدة عادة ما تثبط تعبير MyT في سلائف الحبل العصبي الجانبي.

تم تمييز عامل النسخ GATAa بعلامة فينوس ، وتم تجميعه بالكهرباء إلى أرومة الأديم الظاهر باستخدام محرك pfog. كما هو موضح هنا ، يتم توطين GATAa في الغالب إلى النوى ، كما هو متوقع لعامل النسخ. في حين أن تعبير كوكب الزهرة موجود في كل مكان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التعدي العابر عن طريق التثقيب الكهربائي في زيجوت Ciona المتزامن ، وكيفية التعامل مع الأجنة الهشة المتكللة ، وكيفية العثور على الزاوية الصحيحة للحقن المجهري. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنيات الطريق نحو علم الجينوم الوظيفي. لاستكشاف وظيفة الجينات ، وشبكات تنظيم الجينات ، والحفاظ على الوحدات التنموية ، وهي مهمة لتكوين الأنسجة أيضا في البشر.