وهناك طريقة لعزل الخلايا المستهدفة عبر زجاج Functionalization السطحية

الهدف العام من عملية وظيفية سطح الزجاج هذه هو السماح بالالتقاط والتحرير اللطيف للخلايا المستهدفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تكوّن الأوعية الدموية الورمية، مما يتيح فحص المؤشرات الحيوية الخلوية التي تشير إلى مقاومة الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتخصيص بالكامل، لأي نوع من الخلايا المستهدفة تقريباً.

طالما وجد جسم مضاد متخصص لنوع الخلية، فيمكن تكييف السطح لالتقاطها. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية ثاقبة حول تكوّن الأوعية الدموية السرطانية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أمراض أخرى، حيث تعد العينات المنقاة ضرورية لتطوير أنظمة علاجية أكثر تخصيصاً. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول تطوير آلية تحرير عكسية لالتقاط الخلايا، وذلك باستخدام التفاعل بين desthiobiotin وعائلة adivin.

بعد تنظيف سطح زجاجي في جهاز بلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحضير 2.5 مليليتر من محلول 3-Aminopropyl triethoxysilane المعاد تكوينه بتركيز 2%، أو محلول APTES، عن طريق خلط 50 ميكرولتر من APTES و 2.45 مليليتر من الإيثانول في أنبوب مخروطي. استخدم الماصة لوضع محلول APTES على الأسطح الزجاجية، ثم غطِّ الأسطح وضعها على هزاز منصة في درجة حرارة الغرفة لمدة 50 دقيقة لتوزيع طبقة APTES بشكل متساوٍ. وفي هذه الأثناء، قم بتسخين الفرن مسبقاً إلى 55 درجة مئوية للأطباق ذات الثماني و 24 بئراً، أو إلى 90 درجة مئوية للأطباق الزجاجية.

بعد إزالة الأطباق من جهاز الرج، استخدم الإيثانول لشطف الأسطح الزجاجية وفقاً للبروتوكول المكتوب. جفف الأسطح باستخدام غاز النيتروجين بنسبة 100%. ثم ضع الأطباق ذات الثماني و24 بئراً في الفرن لمدة ساعتين، أو الأطباق الزجاجية في الفرن لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، قم بتحضير 2.5 milliliters من d-Desthiobiotin، أو محلول DSB، عن طريق خلط 1.5 milligrams per milliliter من DSB في 37.5 microliters من DMSO، وإضافة five milligrams per milliliter من EDC إلى 2,462.5 microliters من MES buffer بتركيز 0.1 Molar ورقم هيدروجيني pH 6. ثم ادمج المحلولين معاً. وبعد مرور 15 minutes، أضف one microliter من BME لإيقاف التفاعل بين DSB وEDC.

أخرج الأسطح الزجاجية الساخنة التي تمت معالجتها بـ APTES من الفرن، واتركها تبرد لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. أضف محلول MES المنظم إلى الأسطح الزجاجية لشطفها، مع إمساك الماصة بزاوية 70 درجة بحيث لا يكون الطرف موجهاً مباشرة نحو السطح. ثم قم بتفريغ وسحب المحلول المنظم من نقطة ثابتة، مثل زاوية البئر.

بعد ذلك، استخدم منظم MES للغسل مرتين إضافيتين. ضع محلول DSB على الأسطح الزجاجية. انقلها إلى منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري، ثم غطِّ الطبق، واتركها في الثلاجة لمدة تتراوح بين 18 إلى 24 ساعة.

بعد التحضين عند درجة حرارة 4 °C، استخدم PBS لشطف كل سطح زجاجي ثلاث مرات، كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو. ثم، قم بتخفيف محلول Streptavidin المخزون، أو SAV، ليصل تركيزه إلى 0.4 mg/mL، ووزعه بالتساوي على الأسطح الزجاجية بحيث تتكون طبقة رقيقة. بعد تحضين الزجاج لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة، استخدم 150 µL من PBS لشطف كل سطح ثلاث مرات.

بعد ذلك، قم بترطيب منشفة ورقية بالماء منزوع الأيونات، وضعها بشكل مسطح في طبق بتري بقطر 14 سنتيمتر يحيط بالأطباق للحفاظ على الرطوبة داخل الآبار. غطِّ طبق بتري بالأسطح الزجاجية، وضعه في ثلاجة من المستوى الأول للأمان الحيوي عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى وقت الحاجة إليها. ولإجراء عملية التقاط الخلايا، قم بشفط الوسط من دوارق T175 التي تحتوي على الخلايا.

بعد ذلك، استخدم PBS لشطف الخلايا ثم اسحب المحلول المنظم. أضف 10 milliliters من عامل رفع غير إنزيمي، مثل Cell Dissociation Solution، إلى القارورة. ثم قم بالتحضين عند 37 درجة Celsius لمدة ست دقائق.

بعد مرور ست دقائق، أضف 10 milliliters من HBSS البارد لتخفيف عامل الرفع. ثم اسحب 20 µL من الخلايا واستخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لعدّها. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا عند 500 ×g، في درجة حرارة 4 °C، لمدة خمس دقائق.

واستخدم HBSS لإعادة تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر. قم بعملية السحب والضخ بالماصة لإعادة تعليق الخلايا في المحلول، وللتقليل من تكتل الخلايا الذي قد يقلل من ارتباط الأجسام المضادة. بعد ذلك، قسّم المعلق الخلوي إلى محاليل منفصلة للمجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية.

أضف الأجسام المضادة المبيوتنة إلى محاليل الخلايا المعنية وحضنها في خلاط دوراني عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. استخدم 150 µL من HBSS لغسل الزجاج الوظيفي في أطباق ذات ثماني آبار ثلاث مرات، كما تم توضيحه سابقاً في الفيديو. أضف محلول الخلايا إلى الآبار، وحضنها على الثلج فوق الهزاز لمدة 45 دقيقة.

في هذه الأثناء، قم بتحضير محلول من البيوتين بتركيز 20 millimolar في سائل HBSS معقم. بعد ذلك، وعقب انتهاء فترة الحضن، استخدم 150 microliters من سائل HBSS بلطف لشطف محلول الخلايا من الزجاج. وبعد تكرار عملية الشطف مرتين إضافيتين، أضف 150 microliters من محلول البيوتين إلى كل بئر تحرير مخصص، ثم حضن العينات لمدة 20 دقيقة للسماح بالتفاعل.

قم بجمع الخلايا المرتبطة بشكل غير نوعي باستخدام HBSS لغسل الخلايا. ثم انتقل إلى التصوير والتحليل الفلوري وفقاً للبروتوكول المكتوب. قم بتضمين صور لخلايا حية في دورق كعينة ضابطة.

في هذه التجربة، تم تعريض خلايا MCF7GFP للسطح الوظيفي. وتم التقاط 60% من الخلايا باستخدام الجسم المضاد HLA-ABC. وعند التعرض إلى 20 millimolar من البيوتين، تم تحرير 80% من الخلايا التي تم التقاطها.

كما هو موضح هنا، عند خلط خلايا MCF7GFP مع خلايا RAW 264.7، تم التقاط 50% من البلاعم RAW، وأدت إضافة 20 micromolar من البيوتين لاحقاً إلى تحرير 80% من خلايا RAW الملتقطة. يوضح هذا الشكل أن البلاعم RAW المستخدمة كضابط موجب لا تظهر أي نشاط فلوري. ومع ذلك، فإن خلايا MCF7GFP المستخدمة كضابط سالب موجبة لفلورة GFP.

بما أن فائض الأجسام المضادة يمكن أن يقلل من التقاط الخلايا، فقد تم تحسين تركيز الأجسام المضادة عن طريق المعايرة من صفر إلى 10,000 nanograms per milliliter من أجسام HLA المضادة. وأظهرت النتائج أن التركيز المثالي للأجسام المضادة يتراوح بين 100 و 1,000 nanograms per milliliter. بالإضافة إلى ذلك، حددت تجارب تحسين الخلايا أن التركيز المثالي للخلايا التي يمكن التقاطها يتراوح بين 1 × 10⁵ و 1 × 10⁶ خلية، حيث أن الكميات التي تقل عن هذا العدد تكون أدنى من مستوى الخلفية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أيام، مع استغراق أقل من ست ساعات من وقت التجربة، وذلك دون احتساب فترات الحضن الليلية. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر جمع غسولات الخلايا أثناء التجارب، حيث يمكن أن توفر معلومات حيوية حول فعالية السطح. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل مستويات تعبير المستقبلات التي قد تمتلكها الخلايا المستهدفة.

بعد تطويرها، مهدت عملية وظيفية السطح الطريق للباحثين في مجال المواد الحيوية لاستكشاف التكامل الآمن بيولوجياً للمواد، مثل الغرسات في المرضى الذين يعانون من مجموعة متنوعة من الأمراض والإصابات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء وظيفية السطح للأسطح الزجاجية لالتقاط وتحرير الخلايا المستهدفة، مما يسمح بإجراء التحاليل اللاحقة. لا تنسَ أن العمل مع الخلايا الحية في وجود sodium azide قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل التدريب المناسب، واستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE)، والتخلص السليم من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.