وهناك طريقة لعزل الخلايا المستهدفة عبر زجاج Functionalization السطحية

الهدف العام من عملية وظيفية السطح الزجاجي هذه هو السماح بالالتقاط اللطيف وإطلاق الخلايا ذات الأهمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الأوعية الدموية للورم ، مما يتيح فحص المؤشرات الحيوية للخلايا التي تشير إلى مقاومة الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتخصيص بالكامل ، لأي نوع من أنواع الخلايا ذات الاهتمام.

طالما أن هناك جسما مضادا خاصا بنوع الخلية ، يمكن تكييف السطح لالتقاط السطح. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتكوين الأوعية الدموية للسرطان ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أمراض أخرى لأن العينات المنقاة ضرورية لتطوير أنظمة علاج أكثر تخصيصا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول تطوير آلية إطلاق قابلة للانعكاس لالتقاط الخلايا ، باستخدام التفاعل بين الديسثيوبيوتين وعائلة أديفين.

بعد تنظيف سطح زجاجي في آلة بلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد 2.5 مل من محلول 3-Aminopropyl triethoxysilane المعاد تكوينه بنسبة 2٪ ، أو محلول APTES ، عن طريق الجمع بين 50 ميكرولترا من APTES و 2.45 مل من الإيثانول في أنبوب مخروطي الشكل. قم بضرب محلول APTES على الأسطح الزجاجية ، ثم قم بتغطية الأسطح وضعها على شاكر منصة في درجة حرارة الغرفة لمدة 50 دقيقة لتوزيع طبقة APTES بالتساوي. في غضون ذلك ، سخني الفرن مسبقا إلى 55 درجة مئوية للأطباق المكونة من ثمانية و 24 بئرا ، أو 90 درجة مئوية للأطباق الزجاجية.

بعد إزالة الألواح من الخلاط ، استخدم الإيثانول لشطف الأسطح الزجاجية وفقا لبروتوكول النص. مع غاز النيتروجين 100٪ ، جفف الأسطح. ثم ضع الأطباق المكونة من ثمانية و 24 بئرا في الفرن لمدة ساعتين ، أو الأطباق الزجاجية في الفرن لمدة ساعة.

بعد ذلك ، قم بإعداد 2.5 ملليلتر من d-Desthiobiotin ، أو محلول DSB ، عن طريق خلط 1.5 ملليغرام لكل مليلتر من DSB في 37.5 ميكرولتر من DMSO ، وإضافة خمسة ملليغرام لكل مليلتر من EDC إلى 2 ، 462.5 ميكرولتر من 0.1 مولي MES المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 6. ثم اجمع بين الحلين. بعد 15 دقيقة ، أضف ميكرولتر واحد من BME لإخماد التفاعل بين DSB و EDC.

قم بإزالة الأسطح الزجاجية الساخنة APTES الوظيفية من الفرن ، واتركها لتبرد لمدة خمس إلى 10 دقائق. أضف مخزن MES إلى الأسطح الزجاجية لشطفها عن طريق تثبيت الماصة بزاوية 70 درجة بحيث لا يتم توجيه الطرف مباشرة إلى السطح. ثم قم بتفريغ وسحب المخزن المؤقت من نقطة ثابتة ، مثل زاوية البئر.

بعد ذلك ، استخدم المخزن المؤقت MES للشطف مرتين أخريين. ضع محلول DSB على الأسطح الزجاجية. انقليها إلى منشفة ورقية مبللة داخل طبق بتري ، وغطي الطبق ، واحتضنها في الثلاجة لمدة 18 إلى 24 ساعة.

بعد الحضانة عند أربع درجات مئوية ، استخدم PBS لشطف كل سطح زجاجي ثلاث مرات ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. بعد ذلك ، قم بتخفيف Streptavidin ، أو محلول مخزون SAV ، إلى 0.4 ملليغرام لكل مليلتر ، وقم بتطبيقه بالتساوي على الأسطح الزجاجية بحيث تتشكل طبقة رقيقة. بعد احتضان الزجاج لمدة 18 إلى 24 ساعة ، استخدم 150 ميكرولترا من PBS لشطف كل سطح ثلاث مرات.

ثم بلل منشفة ورقية بالماء منزوع الأيونات ، وضعها بشكل مسطح في طبق بتري بطول 14 سم يحيط بالصفائح للاحتفاظ بالرطوبة في الآبار. غطي طبق بتري بالأسطح الزجاجية وضعيه في ثلاجة السلامة الحيوية من المستوى 1 بأربع درجات مئوية لحين الحاجة. لتنفيذ التقاط الخلية ، استنشق الوسط من قوارير T175 من الخلايا.

ثم استخدم PBS لشطف الخلايا وشفط المخزن المؤقت. أضف 10 مل من عامل الرفع غير الأنزيمي ، مثل محلول تفكك الخلايا ، إلى القارورة. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ست دقائق.

بعد ست دقائق ، أضف 10 مل من HBSS البارد لتخفيف عامل الرفع. ثم ماصة 20 ميكرولترا من الخلايا واستخدم مقياس كثافة الدم لحسابها. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم ، في أربع درجات مئوية ، لمدة خمس دقائق.

واستخدم HBSS لإعادة تعليق الخلايا إلى واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا في المحلول، وتقليل التكتل الخلوي الذي قد يقلل من ارتباط الأجسام المضادة. ثم قم بتقسيم التعليق الخلوي إلى حلول تحكم وتجريبية منفصلة.

أضف الأجسام المضادة الحيوية إلى محاليل الخلايا المعنية واحتضانها على خلاط طرف على نار عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم 150 ميكرولترا من HBSS لغسل الزجاج الوظيفي في أطباق من ثمانية آبار ثلاث مرات ، كما هو موضح سابقا في الفيديو. أضف محلول الخلية إلى الآبار ، واحتضن الثلج على الخلاط لمدة 45 دقيقة.

في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول 20 ملليمولار من البيوتين في HBSS المعقم. ثم ، بعد الحضانة ، استخدم برفق 150 ميكرولتر من HBSS لشطف محلول الخلية من الزجاج. بعد تكرار الشطف مرتين أخريين ، أضف 150 ميكرولترا من محلول البيوتين إلى كل بئر ، واحتضانه لمدة 20 دقيقة للسماح للتفاعل بالمضي قدما.

تذكر الخلايا المرتبطة بشكل غير محدد باستخدام HBSS لغسل الخلايا. ثم انتقل إلى التصوير والتحليل الفلوري وفقا لبروتوكول النص. قم بتضمين صور الخلايا الحية في قارورة كعنصر تحكم.

في هذه التجربة ، تعرضت MCF7GFP الخلايا للسطح الوظيفي. تم التقاط 60٪ من الخلايا باستخدام الجسم المضاد HLA-ABC. عند التعرض ل 20 مليمولار من البيوتين ، تم إطلاق 80٪ من الخلايا التي تم التقاطها.

كما هو موضح هنا عندما تم خلط الخلايا MCF7GFP مع 264.7 خلية RAW ، تم التقاط 50٪ من البلاعم RAW ، وإضافة 20 ميكرومولار من البيوتين الميكرومولار أطلقت لاحقا 80٪ من خلايا RAW التي تم التقاطها. يوضح هذا الشكل أن الضامة RAW للتحكم الإيجابي لا تظهر أي نشاط مضان. ومع ذلك ، فإن التحكم السلبي MCF7GFP الخلايا إيجابي لمضان GFP.

نظرا لأن الأجسام المضادة الزائدة يمكن أن تقلل من التقاط الخلايا ، فقد تم تحسين تركيز الجسم المضاد عن طريق المعايرة من صفر إلى 10،000 نانوغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد HLA. أظهرت النتائج أن تركيز الجسم المضاد المثالي كان بين 100 و 1000 نانوغرام لكل ملليلتر. بالإضافة إلى ذلك ، حددت تجارب تحسين الخلية أن التركيز المثالي للخلايا التي يمكن التقاطها يتراوح بين واحد في 10 إلى الخامس ، وواحد في 10 إلى الخلايا السادسة ، لأن الكميات التي تقل عن هذا الرقم أقل من الخلفية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاثة أيام ، بأقل من ست ساعات من الوقت التجريبي ، لا تشمل الحضانات الليلية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر جمع غسول الخلايا أثناء التجارب ، حيث يمكن أن تعطي معلومات حيوية حول فعالية السطح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل مستويات تعبير المستقبلات التي قد تمتلكها الخلايا ذات الاهتمام.

بعد تطويره ، مهدت وظائف السطح الطريق للباحثين في مجال المواد الحيوية لاستكشاف التكامل الآمن بيولوجيا للمواد ، مثل الغرسات في المرضى لمجموعة متنوعة من الأمراض والإصابات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل الأسطح الزجاجية على السطح لالتقاط الخلايا ذات الأهمية وإطلاقها ، مما يسمح بتحليل المصب. لا تنس أن العمل مع الخلايا الحية في أزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التدريب المناسب ومعدات الوقاية الشخصية والتخلص أثناء تنفيذ هذا الإجراء.