المستمر الموجة ليزر ثوليوم لتسخين الخلايا المستزرعة للتحقيق في الآثار الحرارية الخلوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الاستجابات البيولوجية للخلية المعتمدة على الجرعة الحرارية في المختبر عن طريق تسخين الخلايا المستزرعة مع التحكم الدقيق في درجة الحرارة والوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات التي تبحث في استجابات الخلايا أو الأنسجة لارتفاع الحرارة مثل دراسة العلاج بالليزر في الشبكية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التسخين السريع للخلايا والتحكم الدقيق في مدة التسخين مما يسمح بالتعرض الحراري القابل للتكرار أثناء التجارب.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستجابات الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المزروعة للإشعاع الحراري بالليزر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على نماذج أخرى مثل الخلايا السرطانية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند تسخين الخلايا المحتوية على الميلانين بضوء الليزر المرئي. ومع ذلك ، أدى ذلك إلى اختلاف درجات الحرارة بسبب الاختلافات في التصبغ.

لبدء الإجراء ، ضع لوحا ساخنا في حامل مختبر معدني قابل للتعديل على مقعد نظيف. اضبط اللوح الساخن على 39 درجة مئوية. قم بتأمين ألياف 0.22 NA بقطر أساسي يبلغ 365 ميكرومتر على الذراع الأفقي للحامل.

ضع الذراع المعدني فوق اللوح الساخن واضبط الحامل بحيث يكون طرف الألياف 12 سم فوق اللوح الساخن. قم بتوصيل ليزر ثوليوم 1.94 ميكرومتر 20 واط بشعاع تصويب 365 نانومتر واحد مللي واط بطرف الألياف. ضع طبق ثقافة قطره 30 ملم على الطبق الساخن.

تتبع محيط الطبق بعناية على سطح اللوحة الساخنة ثم قم بإزالة الطبق. قم بتشغيل شعاع التصويب واضبط الحامل حتى يتطابق مركز بقعة الشعاع على لوحة التسخين مع الدائرة التي تم تتبعها. ثم قم بإيقاف تشغيل شعاع التصويب.

لبدء إجراء معايرة درجة الحرارة ، قم بتسخين طرف إبرة قياس 20 باستخدام موقد بنسن. باستخدام طرف الإبرة الساخنة ، اخترق طبق الثقافة الذي يبلغ قطره 30 ملم بالقرب من القاع عند أربع نقاط على بعد 90 درجة لعمل ثقوب يبلغ قطرها حوالي 300 ميكرومتر. ضع شريطا كهربائيا فوق الثقوب.

استخدم إبرة دقيقة لثقب ثقب قطره حوالي 200 ميكرومتر من خلال الشريط الذي يغطي كل ثقب. على الجانب السفلي من طبق الثقافة ، ارسم خطا بين كل زوج من الثقوب على بعد 180 درجة. بدءا من تقاطع الخطوط، ضع علامة على كل ثلاثة ملليمترات شعاعيا على طول كل خط لتعيين نقاط القياس ال 21.

ثم ضع بالضبط 1.2 مل من وسط الثقافة الطازجة المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في الطبق. غطي الطبق وضعي الطبق في الدائرة المتتبعة على الطبق الساخن. قم بتوصيل مزدوجة حرارية بقطر 200 ميكرومتر بكمبيوتر التحكم بالليزر وافتح بروتوكول معايرة درجة الحرارة.

أدخل المزدوجة الحرارية في أحد الفتحات الموجودة في الطبق بحيث يكون الطرف في قاع الطبق في أحد مواقع العلامة. من المهم جدا التحقق مما إذا كان طرف المزدوجة الحرارية يلامس قاع الطبق بالدقة المقاسة لأن درجة الحرارة قد تختلف وفقا للعمق. انتظر حتى يستقر وسط الثقافة عند 37 درجة مئوية.

ثم قم بتشغيل ليزر Thulium واضبط طاقة الليزر على مستوى البداية المطلوب. تحقق من ضبط فترات التسخين المسبق على 140 وثماني ثوان ثم ابدأ تسلسل تشعيع التسخين المسبق. بعد 140 ثانية كما هو موضح بصوت مسموع ، قم بإزالة غطاء طبق الثقافة على الفور.

انتظر حتى ينتهي التسخين المسبق ويحدث التشعيع لمدة 10 ثوان. ثم قم بتغطية الطبق على الفور. قم بقياس درجة الحرارة عند مواقع العلامات 21 بهذه الطريقة.

قم بتنفيذ هذا الإجراء ثلاث مرات لكل منها بفواصل طاقة ثلاث واط تمتد على نطاق طاقة الليزر. بمجرد الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل ليزر الثوليوم. تصدير وتحليل بيانات درجة الحرارة.

قبل التجربة ، استأجرت الثقافة الخلايا الظهارية الصبغية في أطباق استزراع قطرها 30. حافظ على مزارع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ وفحصها باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية. قبل ساعة واحدة من التشعيع ، استبدل وسط الثقافة في كل طبق ب 1.2 مل بالضبط من وسط الاستزراع الطازج.

أعد الثقافات إلى الحاضنة. تحقق من أن محطة التشعيع جاهزة وأن اللوح الساخن مضبوطة على 39 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا لبدء التشعيع ، ابدأ تشغيل ليزر الثوليوم بالطاقة المطلوبة.

افتح بروتوكول التجربة وتحقق من ضبط فترات التسخين المسبق على 140 وثماني ثوان. ضع ثقافة خلايا RPE في طبق مغلق على الموضع المحدد على اللوح الساخن وابدأ على الفور تسلسل تشعيع التسخين المسبق لمدة 140 وثماني ثوان. قم بإزالة غطاء الطبق بعد 140 ثانية من التسخين المسبق.

انتظر حتى ينتهي التسخين المسبق ويحدث التشعيع لمدة 10 ثوان. قم بتغطية الطبق على الفور ، وانتظر سبع ثوان ، ثم أعد الطبق إلى الحاضنة. قم بإشعاع عينات إضافية عند زيادة مستويات طاقة الليزر.

عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل ليزر الثوليوم. لبدء تقييم صلاحية الخلية ، اغسل الخلايا المشععة باستخدام PBS. الحصول على مجموعة قادرة على التمييز بين الخلايا المبرمجة والميتة الحية.

ثم في الإضاءة المنخفضة ، امزج 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم مع 25 ميكرولتر من homodimer -3 و FITC annexin و Hoechst 33342. احتضان الخلايا في محلول التلوين هذا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم اغسل الخلايا باستخدام مخزن مؤقت ملزم 1X مرتين.

استبدل المخزن المؤقت الملزم ب PBS وضع الخلية على مسرح المجهر الفلوري الذي يحتوي على مرشحات DAPI و FITC و TRITC. اضبط مسار ضوء المجهر على عدسة العين وحدد مرشح DAPI. قم بتشغيل ضوء الإضاءة وابحث عن مستوى التركيز البؤري باستخدام عدسة موضوعية 4X.

اضبط مسار الضوء على كاميرا المجهر. استخدم برنامج التصوير المجهري لتوسيط الصورة وتركيزها. حدد معلمات الحصول على الصور باستخدام مرشح DAPI.

كرر عملية التركيز وإعداد الحصول على الصور باستخدام مرشحات FITC و TRITC. ثم استخدم برنامج التصوير للحصول على صور متعددة بثلاث مجموعات مرشحات عبر الطبق ودمجها في صورة واحدة لطبق الثقافة بأكمله. استخدم برنامجا تحليليا لتحديد عتبات درجة الحرارة لموت الخلايا المبرمج وموت الخلايا.

تم تحديد العلاقة النسبية بين الزيادة القصوى في درجة الحرارة في مركز طبق زراعة الخلية وطاقة الليزر من خلال إجراء المعايرة الحرارية الموصوف. ثم كان التوزيع الأقصى لدرجة الحرارة عبر طبق زراعة الخلية مناسبا لوظيفة غاوسية. لوحظت ثلاثة أنماط تلطيخ بعد التشعيع.

لم يلاحظ أي تغيير في الجدوى في الثقافات المعرضة لدرجات حرارة عند أو أقل من 43 درجة مئوية. لوحظ موت الخلايا المبرمج لأول مرة بعد ثلاث ساعات من التشعيع عند 47 درجة مئوية. لوحظ موت الخلايا بعد ثلاث ساعات من 51 درجة مئوية وما فوق.

ثم تم تحديد متوسط درجات حرارة العتبة لموت الخلايا المبرمج وموت الخلايا من خلال تطبيق متوسط نصف القطر المقاس للمناطق الميتة وموت الخلايا المبرمج على الوظيفة الغوسية التي تصف توزيع درجة الحرارة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الإشعاع في ظل العديد من الظروف المختلفة مثل ملفات تعريف الليزر المختلفة وأحجام البقع وأوقات التشعيع. يمكن أن يساعد ذلك في فهم الأسئلة المتعلقة بأسباب درجة الحرارة الموقوتة الفردية والتحقيق فيها على المستوى الخلوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسخين ثقافة الخلية مع التحكم الجيد في درجة الحرارة والوقت. قد يؤثر هذا على إمكانيات دراسة الاستجابات البيولوجية لظروف التشعيع الحراري المختلفة. لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا جدا على عينيك وجلدك.

ابق على اطلاع بالتدريب على السلامة من الإشعاع بالليزر. ارتد دائما نظارات السلامة المناسبة ومعطف المختبر والقفازات عند تنفيذ هذا الإجراء.